产生ＥＰＯ方法的过程中控制技术

本发明专利技术涉及一种测定红细胞生成素的同种型组成的方法，包括下列步骤：ａ）在具有２．５到３．５的下限和５到８的上限的ｐＨ范围在凝胶中对包括红细胞生成素的样品进行等电聚焦，其中包括红细胞生成素的样品来源于产生红细胞生成素的真核细胞的培养上清液；ｂ）将凝胶中包括并分离的蛋白转移到膜；ｃ）通过特异性抗体验证与膜结合的红细胞生成素；并且本发明专利技术涉及一种在发酵生产过程期间用于产生红细胞生成素的真核细胞的培养上清液的过程中控制的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】产生EPO方法的过程中控制本专利技术涉及一种检测红细胞生成素的方法，特别是用于发酵生产过程中产生红细胞生成素的真核细胞的培养上清液的过程中控制(Inprozesskontrolle)的方法。所述过程特征特别在于可以借助等电聚焦(IEF)的专门方法来直接确定产生的红细胞生成素的同种型组成。结合从红细胞生成素含量的测定(优选通过ELISA)获得的数据，可以在发酵过程期间或刚刚结束后评价合成的粗制品的质量，从而可以控制后续的纯化过程。当使用灌流反应器时，这是特别有利的。红细胞生成素(缩写为ΕΡ0)是分子量为约34到39kDa的糖蛋白。它由165个氨基酸的无分枝多肽链以及1个0-糖苷键合(Ser 126)和3个N-糖苷键合(Asn 24, Asn 38 和Asn 83)的糖侧链(碳水化合物部分)组成。侧链由单糖甘露糖，半乳糖，岩藻糖，N-乙酰葡萄糖胺，N-乙酰半乳糖胺和N-乙酰神经氨酸组成。红细胞生成素可以以不同的同种型存在。红细胞生成素分子量的这种差异归因于与神经氨酸衍生物末端连接的糖链的异质性。通过链的不同长度和分枝，可以构建多种“糖分枝”，这产生EPO分子所有同种型的特征。EPO主要在肾中产生，作为生长因子，刺激骨髓中红细胞的形成。在肾衰竭的情况下，受损的肾不产生足够的EPO或根本不产生任何ΕΡ0，因此没有足量的红细胞来源于骨髓干细胞。通过施用生理量的EPO(其刺激骨髓中红细胞的形成)可以治疗这种肾贫血。用于施用的EPO可以获自人尿液或通过基因技术方法产生。因为人体中只包含非常痕量的ΕΡ0， 所以从其天然来源分离EPO对于治疗目的来说几乎是不可能的。因此，基因技术方法提供以更高量产生这种物质的唯一经济可能性。通过基因技术方法重组产生红细胞生成素主要发生在所谓的CHO细胞(中国仓鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary))并且使用基本上3种不同的方法培养真核宿主细胞 (描述于例如 EP-A-O 148 605 和 EP-A-205 564 ；BioProcess Inter-national 2004,46 ； Gorenflo et al.，Biotech.Bioeng. 2002，80，438 和 W09501214)。在分批法中，在培养开始时将培养基和细胞导入生物反应器。直到培养完成之前， 既不添加营养物也不从发酵罐移出细胞，只添加氧气。当一或多种底物被耗尽时，终止所述方法，从发酵上清液收获产物。第二种已知的培养方法是连续法，在其期间向反应器连续注入新鲜培养基，并相应地从发酵罐取出产物。这导致营养物的连续供应，同时不想要的代谢产物诸如生长抑制物铵和乳酸盐被去除或稀释。因此，借助于这种方法可以实现更高的细胞密度并在相当长的时间段内得到维持。所谓的透析反应器是连续法的特例，其能够使高分子物质诸如蛋白保留在发酵罐中，而可以添加低分子物质诸如底物或从系统中去除主要的副产物铵和乳酸盐。灌注反应器用于利用不同细胞保留系统的化合物和蛋白的微生物产生的用途也是公知知识，并且也进行了有关EPO的描述。最后，第三种可能的方法是补料分批发酵法，其中培养从全部发酵罐体积的分数量开始，在较短生长期后添加新鲜底物。这能够产生比分批法更高的细胞密度和更长的处理时间。这种方法的另一优势是细胞代谢受补料程度的影响，这可以造成更少的废物产生。与连续法相比，细胞产物可以在更长的时间段内在发酵罐中聚集，从而实现更高的产物浓度，使得后续处理(Aufarbeitimg)更容易。广泛的层析纯化方法与发酵方法结合以便从上清液分离ΕΡ0，其可以用于治疗， 对应于欧洲药典(Ph. Eur. ；01/2002 :1316))或 Guidance on Biosimilar Medicinal Products Containing Recombinant Erythropoietins (EMEA/CHMP/94256/2005))白勺标准品。在这方面，本领域现有技术描述于多种方法，诸如W0-A-05/121173，EP-A-O 228 452，EP-A-O 267 678，EP-A-O 830 376，EP-A-I 127 063，W0-A-03/045996, EP-A-O 428 267 和 W02005121173。根据本领域现有技术公开的方法，将包括红细胞生成素的样品用于聚丙烯酰胺凝胶的分离方法(例如等电聚焦)，通过施加电场分离样品中包含的蛋白。电泳之后进行所谓的免疫印迹(免疫-印刷或免疫-转移)，在此期间蛋白被转移到膜上。因此，在膜表面获得各个蛋白的拷贝。使用的膜具有下列优点蛋白主要由于疏水性相互作用而被牢固固定，并且膜以化学中性方式起作用。由于EPO分子位于膜表面，对于抗体(用于使红细胞生成素可见)来说它们是容易接近的。借助于等电聚焦，可以分离红细胞生成素的同种型。为了检测红细胞生成素，首先将膜与特异性结合全部现有EPO分子的单克隆抗 EPO抗体温育。其他蛋白不与抗体反应。可以从膜洗去未与EPO结合的单克隆抗体，因为膜表面的剩余部分起初已被非特异性蛋白封闭。抗体与EPO的结合是可逆的，因为它基于非共价相互作用，因此可以例如通过改变PH值而逆转。在双印迹方法中，将结合红细胞生成素的抗体转移到第二膜在酸性环境下抗体改变其结合结构域构象，当施加电场时，单克隆抗体从EPO分子解离并穿过电场向着阴极方向，在那里它与第二膜结合。EPO分子以及其他非特异性蛋白仍保留在第一膜，因为与第一膜的结合不受pH值波动的影响。采用这种方式获得EPO条带的新拷贝。但是，在第二模上除了特异性单克隆抗体(其先前结合固定在第一膜上的红细胞生成素分子)以外不存在红细胞生成素分子。通过第二抗体(二抗)(其与抗EPO单克隆抗体反应)使抗体条带可见。这种第二抗体与特定酶(例如碱性磷酸酶或过氧化物酶)偶联，所述酶在发生显色反应期间催化底物的转化。归因于非特异性信号的降低，第二转移是必需的，因为酶标二抗无法非特异性地与第一膜上的其他样品部分反应。此外，通过抗体-酶-缀合物与第一抗体的多重键合，信号的放大和灵敏度的相关增加是可能的。双印迹方法的一个缺点是显著更高的材料和时间消耗。因此，用于检测红细胞生成素的方法在本领域现有技术中已被公开，并且对本领域技术人员来说是公知的，但是为了检测红细胞生成素，如上所述使用显著更复杂的双印迹方法(Chuan et al. , Cytotechnology 2006,51,67-79 ；Hol-Iaender et al.， Laborpraxis Dezember 2004,56-59 ；Lasne,Journal of Immu-nological Methods 2003, 276，223-226)，或者，当使用电聚焦方法时，只有一部分必需pH范围在凝胶上显示，这样的话同种型分离的选择性不足以评价EPO粗制品的质量(Wimmer et al. , Cytotechnology 1994，16，137-146)。但是，本领域现有技术公开的红细胞生成素检测方法过于复杂，不适于红细胞生成素发酵生产中的过程中控制。本专利技术的目的是提供简化和改进的红细胞生成素检测方法，用于过程中控制，其中所述过程能够表征来自EPO发酵过程的培养上清液，本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．用于确定红细胞生成素的同种型组成的方法，包括下列步骤：ａ）在具有２．５到３．５的下限和５到８的上限的ｐＨ范围在凝胶中对包含红细胞生成素的样品进行等电聚焦，其中包括红细胞生成素的样品来源于产生红细胞生成素的真核细胞的培养上清液；ｂ）将凝胶中包括并分离的蛋白质转移到膜；ｃ）通过特异性抗体验证与膜结合的红细胞生成素。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：FR·孔茨，
申请(专利权)人：赢创德固赛有限公司，
类型：发明
国别省市：DE