用于从试剂中去除核酸污染物的方法技术

总体而言，本文公开的本方法可以用于从微生物衍生的试剂、ＰＣＲ（和ＲＴ－ＰＣＲ）相关装置和过程（材料和装置），包括用于分离、纯化和检测核酸的样品制备试剂和材料中去除污染性微生物和核酸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
总体而言，公开的本专利技术涉及净化用于分析反应如核酸扩增反应或Sanger测序 反应中核酸的DNA或RNA污染的试剂。
技术介绍
聚合酶链式反应(PCR)是允许指数扩增较长的双链核酸分子内核酸序列的方法。 所述核酸可以是DNA或者是RNA。PCR可以通过首先使用逆转录酶将RNA转换成互补的 DNA (cDNA)，然后用PCR扩增所述互补DNA从而扩增和检测RNA。为了定量检测靶核酸分子 研发了实时PCR。一种监测PCR扩增过程的方法通过向PCR反应混合物中加入对双链DNA 特异的荧光染料或者在实时PCR反应中使用经标记的探针而进行。荧光强度在PCR反应的 对数扩增期过程中的每个热循环后加倍。STOR Green染料是一个结合至双链DNA而不是 单链DNA的染料的一个例子并且经常用于实时PCR反应。PCR是非常敏感的技术，其能够检测小至单个的靶核酸分子。但是，为了获得单个 分子检测的敏感性和特异性，用于PCR中的试剂、材料和装置应该没有污染性核酸。典型的 PCR主混合试剂(master mix reagent)混合物的成分包括但不限于至少热稳定的DNA聚合 酶、dNTP、盐和可选地逆转录酶、荧光染料和各种添加剂。寡核苷酸引物(和探针)不掺入 PCR主混合物中而是在进行PCR之前加入至PCR反应混合物中。商业上提供的一般PCR主 混合物成分都不能在无细菌/无微生物和/或无细菌核酸条件下获得。事实上，在以细菌 为靶标的PCR反应中已经观察到无模板对照(NTC)的(^值。用于PCR反应中的酶成分经常通过重组DNA方法制备。使用的聚合酶有细菌来源。 因此，从商业供应商获得的PCR主混合物反应成分永远都不能完全保证没有微生物或微生 物的核酸。因为PCR主混合物含有就生物性质和化学性质而言不同的成分，作为去除核酸 污染物方法的过滤可以改变PCR反应混合物的一种或多种成分，引起PCR效率的降低。从 单个PCR成分中纯化和去除污染性核酸是可行的，但是需要对每个类型的成分范畴开发和 优化几种技术如大小排除、离子和亲和过滤。这增加了制造过程的复杂性和成本。当处理DNA或RNA时，核酸的扩增、分离或纯化是目标。在核酸酶处理后残余核酸 酶的存在可以破坏靶核酸模板，造成分离的核酸产率的降低，不能扩增或检测靶核酸序列 和降解的分离的核酸。当使用核酸用于其中样品大小非常有限的诊断或法医应用时，靶核 酸的纯度和稳定性也是严重的问题。降解靶核酸样品的污染性核酸的存在可以使得分析无 效。另外，生物制药制造业要求制造过程引起的残余核酸或微生物的量最小化。污染性微 生物和其核酸可以妨碍残余微生物和核酸水平的准确评估。因此本领域存在从用于研究、 制造业、诊断、法医、核酸分离和纯化方法中的分子生物学和生物制药试剂和装置中去除污 染性核酸的需求。因此，建立没有微生物细胞和核酸的PCR主混合试剂盒是非常有挑战性的。
技术实现思路
本教导的一个具体实施方案包括从主混合试剂和其成分中去除核酸(例如污染 性微生物核酸)的方法。所述方法使用加入至主混合物成分中或加入至主混合物本身(减 掉引物和探针)的脱氧核糖核酸酶(DNase)或者是核糖核酸酶(RNase)的核酸酶。核酸酶 可以作为溶液加入或结合至不溶性基质或固体支持物如选自磁珠、非磁性珠子、玻璃珠或 纤维素珠上。可以通过过滤、离心或磁性分离去除固定的核酸酶。或者，核酸酶可以用热在 孵育后失活。本教导还提供了制备用于检测试剂或制药原材料和成品中痕量微生物污染物的 实时PCR试剂盒的方法。为了说明，测试试剂盒中的所有试剂可以基本上没有污染性微生 物和微生物核酸。本教导提供了有效的简单的从PCR主混合物或相似的含有具有不同化学 性质的成分的试剂中同时去除污染性微生物和核酸的实现方法。本教导还提供了去除PCR主混合试剂中核酸污染物的方法，所述方法通过以下进 行a)向PCR主混合试剂中加入核酸酶，b)在有效的温度下孵育含有核酸酶的PCR主混合 试剂足够的时间从而消化污染性核酸(例如DNA)，和c)灭活核酸酶的活性。核酸酶起水解DNA 或RNA分子的作用，所述DNA或RNA分子如果存在的话，在含有PCR主混合物的试剂成分中。本教导还提供了在本主题方法的一些具体实施方案中固定在珠子上的核酸酶的 用途。珠子选自磁珠或非磁性珠子。可以在完成核酸酶反应后通过离心、过滤或磁性分离 将核酸酶-珠子复合物从试剂中分离出来。本教导还包括去除PCR主混合物中的微生物核酸污染物的方法，其包括a)使PCR 主混合物以优化的流速和温度穿过填充了包被固定核酸酶珠子的柱或内部包被核酸酶的 管从而消化污染性核酸和b)收集核酸酶处理的PCR主混合物。在另一具体实施方案中，本教导还适用于去除PCR主混合物中微生物RNA污染物 的方法，所述方法通过以下进行a)将PCR主混合物暴露给固定在固体支持物上的核糖核 酸酶，b)在有效的温度下将PCR主混合试剂与固定的核糖核酸酶孵育足够的时间从而消化 RNAjPc)从PCR主混合物中去除固定的核糖核酸酶。RNase (核糖核酸酶)酶通过磷酸化 或水解起作用。该方法还适用于通过使用脱氧核糖核酸酶去除污染性DNA。在另一个具体实施方案中，本教导提供了通过将多种核酸酶加入成分中或试剂混 合物中，孵育获得的混合物然后去除或灭活多种核酸酶而从试剂成分中或试剂混合物中去 除核酸污染物的方法。多种核酸酶可以作为溶液加入、结合至不溶性基质或固体支持物上 或其组合。固体支持物可以是选自磁珠、非磁性珠子、玻璃珠或纤维素珠。固定的核酸酶可 以通过过滤、离心或磁性分离去除。或者，核酸酶可以通过加热然后孵育而灭活。多种核酸 酶可以是至少两种脱氧核糖核酸酶、至少两种核糖核酸酶或至少一种脱氧核糖核酸酶和至 少一种核糖核酸酶的组合。在另一个具体实施方案中，本教导提供了无核酸酶的试剂、PCR主混合物、PCR主 混合物的成分或用于分离核酸的装置，通过以下制备a)向污染的试剂或装置中加入核酸 酶，b)在有效的温度下孵育污染的试剂或装置足够的时间从而消化污染性核酸(例如DNA 或RNA)，和c)灭活核酸酶的活性。所述过程使用的核酸酶，是加入至污染的试剂或装置中 的脱氧核糖核酸酶或核糖核酸酶。可以以溶液或结合至不溶性基质或固体支持物如选自磁 珠、非磁性珠子、玻璃珠或纤维素珠的珠子的方式加入核酸酶。固定的核酸酶可以通过过滤、离心或磁性分离去除。或者，核酸酶通过加热然后孵育而灭活。 附图说明技术人员理解下面描述的图只是为了说明的目的。图不是为了以任何方式限制本 教导的范围。图1. TURBO DNase 酶处理掺入DNA的PCR主混合物。脱氧核糖核酸酶处理在37 °C 进行(a) 0分钟、(b) 10分钟、(c) 20分钟、(d) 30分钟和(e) 40分钟。通过在75°C热处理10 分钟灭活脱氧核糖核酸酶。图2. TURBO DNase 酶处理掺入DNA的PCR主混合物。首先将TURBO DNase 酶在 75°C加热10分钟。然后，脱氧核糖核酸酶处理在37°C进行(a)0分钟、(b) 10分钟、(c) 20 分钟、(d)30分钟和(e)40分钟。然后在75°C 10分钟灭活脱氧核糖核酸酶。图3.使用脱氧核糖核酸酶处理的(右)和未处理的(左)PC本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种用于去除ＰＣＲ主混合试剂中核酸污染物的方法，包括：ａ．向ＰＣＲ主混合试剂中加入核酸酶；ｂ．孵育ＰＣＲ主混合试剂加核酸酶；和ｃ．灭活所述核酸酶。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US61/055,8642008年5月23日1.一种用于去除PCR主混合试剂中核酸污染物的方法，包括a.向PCR主混合试剂中加入核酸酶；b.孵育PCR主混合试剂加核酸酶；和c.灭活所述核酸酶。2.根据权利要求1所述的方法，其中PCR主混合物为扩增微生物核酸而配制。3.根据权利要求1所述的方法，其中核酸酶是脱氧核糖核酸酶或核糖核酸酶。4.根据权利要求1所述的方法，其中用热灭活核酸酶。5.根据权利要求1所述的方法，其中核酸酶结合至固体表面。6.根据权利要求5所述的方法，其中固体表面是珠子。7.根据权利要求6所述的方法，其中珠子选自磁珠、非磁性珠子、玻璃珠或纤维素珠。8.根据权利要求6所述的方法，还包括通过离心、过滤或磁性分离去除核酸酶。9.去除溶液中DNA污染物的方法，包括a.使溶液穿过填充了包被固定脱氧核糖核酸酶珠子的柱或内部包被脱氧核糖核酸酶 的管；和b.从柱或管中收集经脱氧核糖核酸酶处理的溶液。10.去除溶液中RNA污染物的方法，包括a.将核糖核酸酶加入溶液；b.孵育带有核糖核酸酶的溶液；和c.灭活核糖核酸酶。11.根据权利要求10所述的方法，其中核糖核酸酶结合至固体表面。12.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：Y·刘，
申请(专利权)人：生命技术公司，
类型：发明
国别省市：US