从ＨＣＶ感染的样品扩增ＨＣＶ核酸的方法，包括通过两步ＰＣＲ扩增互补于来自样品的ＨＣＶ ＲＮＡ的基因组的ＤＮＡ模板的区段，其中第一步ＰＣＲ使用第一外引物和第二外引物，并且第二步ＰＣＲ使用第一内引物和第二内引物。第一外引物的核苷酸序列包含ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２或ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９所示的核苷酸序列，其中任选地，１、２或３个核苷酸是ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９的那些核苷酸之外的其它核苷酸。第二外引物的核苷酸序列包含ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３或ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４所示的核苷酸序列；或ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０或ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１所示的核苷酸序列，其中任选地，１、２或３个核苷酸是ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０和ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１的那些核苷酸之外的其它核苷酸。第一内引物的核苷酸序列包含ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５或ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２所示的核苷酸序列，其中任选地，１、２或３个核苷酸是ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２的那些核苷酸之外的其它核苷酸。第二内引物的核苷酸序列包含ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６或ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７所示的核苷酸序列；或ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３或ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４所示的核苷酸序列，其中任选地，１、２或３个核苷酸是ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３和ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４的那些核苷酸之外的其它核苷酸。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利技术人Ann D. Kwong, James Daniel Frantz, Douglas J. Bartels, Chao Lin, Benjamin Shames, Sheila Seepersaud, Judith A. Lippke, Tara L. Kieffer, Yi Zhou, Eileen Z. Zhang 禾口 James C. Sullivan代理机构案卷号VPI/08-120W0相关申请本申请要求2009年1月21日递交的美国临时申请号61/146，083的优先权，该文献的全部教导在此通过引用方式并入本文。
技术介绍
丙型肝炎病毒(HCV)是黄病毒科的正的有义单链RNA病毒。HCV是世界范围内慢性肝病的主要诱因，并且仍然是输血后非甲型非乙型肝炎的最常见的诱因之一。在感染HCV 的人员中，20% -25%可能能够在急性感染之后清除该病毒，但是75% -80%将产生慢性丙型肝炎感染(见，例如 Frontiers in Viral Hepatitis 的序言，编者R. F. Chinazi，J. -P. Sommadossi, and C. Μ. Rice, p. xi.，Elsevier (2003)) 这经常导致复发性和逐渐恶化的肝的炎症，经常形成更严重的状态，例如肝硬化和肝细胞癌。获得HCV基因组的信息并对其进行定量能够促进开发多种用于诊断和/或治疗患者中的HCV感染的方法。一般地，分析HCV基因组的相对长的片段将提供从多个相对较短的片段不能获得的更多的序列信息。然而，一般难以通过常规聚合酶链式反应(PCR)扩增那些在PCR扩增之前需要逆转录(RT)步骤的长的RNA基因组(例如，超过51Λ)。当试图扩增具有例如大于8，000个碱基对的HCV基因组或全长HCV基因组时，这种情况尤其更具挑战。另外，一般难于以相对高的重现性从获自临床和流行病学研究的样品扩增如此长的 HCV基因组。因此，需要新的扩增和测定HCV基因组的方法。特别是需要具有相对高的重现性 (例如大于80%，大于85%，或大于90%)的新的扩增和测定具有大于8，000个碱基对(例如全长HCV)的HCV核酸的方法。
技术实现思路
本专利技术一般地提供了扩增HCV核酸的方法，测定HCV核酸的方法，其试剂盒和引物。在一个方面，本专利技术提供了从HCV感染的样品扩增丙型肝炎病毒(HCV)核酸的方法。该方法包括通过两步聚合酶链式反应(PCR)扩增互补于来自样品的HCV RNA的基因组的DNA模板的区段，其中第一步PCR使用第一外引物和第二外引物，并且第二步PCR使用第一内引物和第二内引物。在一个实施方式中，该方法还包括使用RT引物通过逆转录(RT) 形成互补于来自样品的HCV RNA的基因组的DNA模板。在另一个方面，本专利技术提供了测定来自HCV感染的样品的丙型肝炎病毒(HCV)核酸的方法。该方法包括通过两步聚合酶链式反应(PCR)扩增互补于来自样品的HCV RNA的基因组的DNA模板的区段，其中第一步PCR使用第一外引物和第二外引物，并且第二步PCR 使用第一内引物和第二内引物。该方法还包括对扩增的HCV核酸进行测序。在一个实施方式中，该方法还包括使用RT引物通过逆转录(RT)形成互补于来自样品的HCV RNA的基因组的DNA模板。在另一个方面，本专利技术提供了用于扩增和/或测定HCV感染的样品中的HCV核酸的试剂盒。在一个实施方式中，试剂盒包含含有第一外引物和第二外引物的PCR外引物对。 在一个实施方式中，试剂盒包含含有第一内引物和第二内引物的PCR内引物对。在另一个实施方式中，试剂盒包含RT引物、包含第一外引物和第二外引物的PCR外引物对，和包含第一内引物和第二内引物的PCR内引物对。在一个实施方式中，RT引物的核苷酸序列包含SEQ ID NO 1 ；第一外引物的核苷酸序列包含SEQ ID NO :2 ；第二外引物的核苷酸序列包含SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4 ；第一内引物的核苷酸序列包含SEQ ID NO 5 ；并且第二内引物的核苷酸序列包含SEQ ID NO 6 或 SEQ ID NO 7 5，-(A)n-AAAA-3，(SEQ ID NO :1)，其中η是H6的整5，-GAGTAGTGTTGGGTCG--3，(SEQ ID NO2)5，-CACGCTGTGATAAATG--3，(SEQ ID NO3)5，-CAVGCTGTGATATATG--3，(SEQ ID NO4)5，-GGTGCTTGCGAGTGCC--3，(SEQ ID NO5)5，-TAGCCAGCCGTGAACC--3，(SEQ ID NO6)禾口5，-TARCCAGCRACGAACC--3，(SEQ ID NO7),其中V是A、C或G ；并且R是A或G。在另一个实施方式中，RT引物的核苷酸序列在其3，末端包含SEQ ID NO 1 ；第一外引物的核苷酸序列在其3’末端包含SEQ ID NO :9所示的核苷酸序列，其中任选地，其1、 2或3个核苷酸独立地是SEQ ID NO :9的那些核苷酸之外的其它核苷酸；第二外引物的核苷酸序列在其3，末端包含SEQ ID N0:10或SEQ ID NO :11所示的核苷酸序列，其中任选地，其1、2或3个核苷酸独立地是SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11的那些核苷酸之外的其它核苷酸；第一内引物的核苷酸序列在其3’末端包含SEQ ID NO :12所示的核苷酸序列，其中任选地，其1、2或3个核苷酸独立地是SEQ ID NO 12的那些核苷酸之外的其它核苷酸； 第二内引物的核苷酸序列在其3，末端包含SEQ ID N0:13或SEQ ID N0:14所示的核苷酸序列，其中任选地，其1、2或3个核苷酸独立地是SEQ ID N0:13和SEQ ID N0:14的那些核苷酸之外的其它核苷酸5，-(A)n-AAAA-3，(SEQ ID NO :1)，其中 η 是 1-26 的整数；5，-CAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCG-3，(SEQ ID NO 9)；5，-CCGGGCAYGAGACACGCTGTGATAAATG-3，(SEQ ID NO 10)；5，-TCGGGCACGAGACAVGCTGTGATATATG-3，(SEQ ID NO 11)；5’-GTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCC-3，(SEQ ID NO 12)；5，-TCTCCCCCGCTGTAGCCAGCCGTGAACC-3，(SEQ ID NO 13)；禾口5，-TCTCCCCCGCTGTARCCAGCRACGAACC-3，(SEQ ID NO: 14)，其中V是A、C或G;R是A或G ；并且Y是C、T或U。在另一个实施方式中，RT引物的核苷酸序列在其3，末端包含SEQ ID NO 1 ；第一外引物的核苷酸序列在其3’末端包含SEQ ID NO :9所示的核苷酸序列，其中任选地，其1、 2或3个核苷酸独立地是SEQ ID NO :9的那些核苷酸之外的其它核苷酸；第二外引物的核苷酸序列在其3，末端包含SEQ ID N0:10或SEQ ID NO :11所示的核苷酸序列，其中任选地，其1、2或3本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．从ＨＣＶ感染的样品扩增丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核酸的方法，包括通过两步聚合酶链式反应（ＰＣＲ）扩增互补于来自样品的ＨＣＶＲＮＡ的基因组的ＤＮＡ模板的区段，其中第一步ＰＣＲ使用第一外引物和第二外引物，并且第二步ＰＣＲ使用第一内引物和第二内引物，其中：ｉ）第一外引物的核苷酸序列包含ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２：５’－ＧＡＧＴＡＧＴＧＴＴＧＧＧＴＣＧ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２），ｉｉ）第二外引物的核苷酸序列包含ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３或ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４：５’－ＣＡＣＧＣＴＧＴＧＡＴＡＡＡＴＧ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）或５’－ＣＡＶＧＣＴＧＴＧＡＴＡＴＡＴＧ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４），其中Ｖ是Ａ、Ｃ或Ｇ；ｉｉｉ）第一内引物的核苷酸序列包含ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５：５’－ＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧＴＧＣＣ－３ＩＤ ＮＯ：７），其中Ｒ是Ａ或Ｇ。’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５），并且ｉｖ）第二内引物的核苷酸序列包含ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６或ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７：５’－ＴＡＧＣＣＡＧＣＣＧＴＧＡＡＣＣ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）或５’－ＴＡＲＣＣＡＧＣＲＡＣＧＡＡＣＣ－３’（ＳＥＱ
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：A·D·孔，
申请(专利权)人：沃泰克斯药物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：US
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