靶基因组序列富集的方法和系统技术方案

本发明专利技术提供用于在样品中富集靶核酸序列的方法和系统。具体地讲，本发明专利技术提供在杂交测定的杂交期间通过首先去除非靶核酸序列而进行靶核酸序列的富集。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术提供用于富集靶基因组序列的方法和系统。具体地讲，本专利技术提供在杂交测定的杂交期间通过去除靶基因组中的非靶核酸序列而进行靶核酸序列的富集。
技术介绍
核酸微阵列技术的出现使人们有可能在很小的区域例如在显微镜载玻片上建立起数以百万计的核酸序列的阵列(例如美国专利号6，375，903和5，143，854)。最初，通过将预合成的DNA序列点样到载片上而产生这样的阵列。然而，美国专利号6，375，903所述的无屏蔽阵列合成仪(maskless array synthesizer, MAS)的建立现已允许直接将寡核苷酸序列在载片自身上原位合成。使用MAS仪器，对要在微阵列上建立的寡核苷酸序列的选择是在软件控制下进行，这样能根据研究人员的具体需要而分别创建用户定制的阵列。一般而言，基于MAS的寡核苷酸微阵列合成技术允许在标准显微镜载玻片的很小区域上平行合成几百万个独特寡核苷酸元件(feature)。随着上百种生物的全基因组的可用性(其参考序列通常已经保存在公共数据库中)，微阵列已经用于对分离自大量生物体的核酸进行序列分析。核酸微阵列技术已用于研究和诊断的许多领域，例如基因表达和发现、突变检测、 等位基因和进化序列比较、基因组作图、药物发现等。许多应用需要跨整个人类基因组搜索遗传变体和突变，它们是人类疾病的基础。就复杂疾病而言，这些搜索通常导致疾病和/或疾病危险相关的单核苷酸多态性(SNP)或SNP组。鉴别这样的SNP被证明是费力的而且经常是毫无结果的工作，因为需要对来自患病个体或组织样品的大区域基因组DNA(经常大于100千碱基(Kb))进行测序，以找到一个碱基变化或鉴别所有的序列变体。其它应用包括鉴别染色体序列的得失，其也可能与例如以下癌症相关淋巴瘤(Martinez-Climent JA 等，2003，Blood 101 :3109-3117)、胃癌(Weiss MM 等，2004，Cell. Oncol. 26 :307-317)、乳癌(Callagy G 等，2005，J. Path. 205:388-396)和前列腺癌(Paris，PL 等，2004，Hum. Mol. Gen. 13 :1303-1313)。同样，微阵列技术对于科学研究人员和临床医生了解疾病和治疗疾病的治疗方案的功效而言是一种特别有用的工具。基因组通常过于复杂，无法对进行整体研究，而且必须使用降低基因组复杂度的技术。针对这个问题，一种解决方法就是将DNA样品中某些类型的大量序列减少，正如美国专利6，013，440中所述。替代方案使用例如以下文献所述的用于富集基因组序列的方法和组合物=Albert 等 Q007，Nat. Meth.，4 :903-5)，Okou 等 Q007，Nat. Meth. 4 :907-9)， Olson M. (2007, Nat. Meth. 4 :891-892)，Hodges 等(2007, Nat. Genet. 39 :1522-1527)和美国专利申请序列号11/638，004,11/970, 949和61/032，594。Albert等人公开了以用户定义的方式，既合算又快速地有效减低基因组样品复杂度的替代方案，以允许进一步处理和分析。Lovett 等人(1991,Proc. Natl. Acad. Sci. 88 :9628-9632)也描述了使用细菌人工染色体(BAC)进行基因组选择的方法。通过先实施靶序列富集，再进行测序而降低基因组的复杂度，远胜过仅单独测定杂交事件。杂交事件允许在微阵列或溶液中进行任何物种的杂交；靶序列和非靶序列都同样如此。通过实施复杂度降低和序列富集，研究人员提高了对靶4序列(例如作为测定焦点的那些序列)的捕获，同时减少了所捕获的非靶序列(例如并非测定焦点的那些)的量。然而，涉及任何杂交测定的一个问题就是在靶核酸杂交期间，在阵列上或溶液中的非靶(例如重复)核酸序列的交叉捕获事件，也称为非靶核酸序列的次级捕获 (secondary capture)。次级捕获使得在杂交测定中降低复杂度的效率下降，事实上潜在地使非靶捕获干扰了所需靶捕获，导致靶捕获效率降低。目前的方法是通过向杂交测定中加入基因组封闭剂DNA (例如CJ-1DNA)而抑制次级捕获。如果没有额外DNA加入到实验中， 这将是优选的，但目前的实践不提供该可选方法。同样，需要的是用于处理杂交测定中的次级捕获的方法，即通过不包括加入不需要的核酸、而同时又能提高靶核酸捕获效率的替代方法，用于研究工作。专利技术概述本专利技术提供用于靶序列富集的方法和系统。具体地讲，本专利技术提供在杂交测定的杂交期间通过去除靶基因组中的非靶核酸序列而进行靶核酸序列的富集。在微阵列形式上的次级捕获反应导致捕获靶核酸的效率降低。这样减低的效率可从微阵列测定所得到的命中靶标读数(on-target read)的百分率而看出，使得当次级捕获未受抑制或忽略(bypass)时，所捕获的非靶核酸量增加，而靶核酸减少。本专利技术被概述为用于在微阵列测定中处理次级捕获的方法、系统和组合物。本专利技术的某些说明性实施方案描述如下。本专利技术并不限于这些实施方案。本专利技术的实施方案包括固定化核酸探针，以从例如基因组样品中捕获靶核酸序列，即通过使样品与固相支持体上或溶液中的探针或源自探针的扩增子杂交来进行。在杂交发生在固相支持体或基底上的实施方案中，预期的是本专利技术并不限制所使用的固相支持体。固相支持体或基底包括但不限于微阵列基底，例如玻片、芯片、珠、管、柱、孔、板等。本文所述的杂交反应包括将样品施加到一个或多个支持体上，所述支持体上固定有非靶序列探针或靶序列探针，或这两者。在一个实施方案中，提供一个两阶段过程，其中施加样品并与固定在第一支持体上的非靶序列探针杂交，移出样品(例如所移出的样品去除了非靶序列)并与固定在第二支持体上的靶序列探针杂交。杂交的靶序列优选再经非选择性洗脱，从而去除样品中的非靶序列并富集靶核酸序列，而无需使用次级捕获封闭剂 DNA。在另一个实施方案中，提供一个一阶段过程，其中施加样品并与一个支持体杂交， 所述支持体上分别具有非靶序列探针和靶序列探针的分开的群体，其中杂交同时发生在非靶核酸序列和靶核酸序列。再将杂交的靶序列从各自位置上非选择性洗脱下来，从而去除样品中的非靶序列并富集靶核酸序列，同时无需使用次级捕获封闭剂DNA。在优选的实施方案中，支持体上的固定化非靶序列探针的数量或含量大于等于杂交样品中存在的非靶序列的数量或含量。在某些实施方案中，本专利技术提供在基于溶液的形式中对靶序列的富集和对非靶序列(例如重复序列)的去除。在一个优选的实施方案中，两阶段过程适用于通过包括以下步骤的方法进行溶液杂交a)在包含与非靶核酸序列互补的序列的溶液中产生第一组杂交探针；b)在包含与靶核酸序列互补的序列的微阵列上产生第二组杂交探针；c)将第一组探针与样品混合，让第一组探针在溶液中与非靶核酸杂交；d)从样品中移出已杂交的第一组探针，形成包含靶核酸序列的第一富集溶液；e)将微阵列上的第二组探针与第一富集溶液混合，让第二组探针与靶核酸杂交；f)移出已杂交的第二组探针；和g)将靶序列从已杂交的第二组探针上洗脱下来，形成包含靶核酸序列的第二富集溶液。在上述两阶段溶液相方法的另一本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种在样品中富集靶核酸序列的方法，所述方法包括：ａ）将包含核酸序列的样品施加到第一组杂交探针并让其杂交，其中所述核酸序列包括非靶核酸序列和靶核酸序列，所述杂交探针包含与样品中的非靶核酸序列互补的序列，ｂ）将包含未杂交靶核酸序列的溶液与已杂交非靶序列分开，ｃ）将所述包含未杂交靶核酸序列的溶液施加到第二组杂交探针并让其杂交，其中所述第二组杂交探针包含与所述靶核酸序列互补的序列，和ｄ）从第二组杂交探针上洗脱所述已杂交靶核酸序列，从而富集样品中的靶核酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·格哈特，
申请(专利权)人：霍夫曼拉罗奇有限公司，
类型：发明
国别省市：CH