一种混合细胞培养生产纯人源单克隆抗体的方法技术

本发明专利技术一种混合细胞培养生产纯人源单克隆抗体的方法，该方法将T细胞、B细胞、人体淋巴结内皮细胞进行共同培养，将特异性的免疫细胞经抗原激活，促进B细胞分裂及增值，从而获得抗原特异性的单克隆抗体细胞株，再获得纯人源单克隆抗体。本发明专利技术采用的技术为混合细胞培养法，简单易行，操作方便，一步到位，筛选过程简单，节省大量人力物力；单抗生产效率大大提高，融合细胞产生抗体的比例成倍增加；本发明专利技术的大多数的克隆成功的实现了从IgM到IgG的类型转化，生产IgG型单抗几率大大提高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于免疫球蛋白制备领域，具体涉及，该方法将τ细胞、B细胞、人体淋巴结内皮细胞进行共同培养，将特异性的免疫细胞经抗原激活，促进B细胞分裂及增值，从而获得抗原特异性的单克隆抗体细胞株，再获得纯人源单克隆抗体。
技术介绍
单克隆抗体制药是目前生物制药中发展最为迅速的生物
目前单抗药物研发生产大致分为3类1)动物(包括人源化小鼠)直接免疫法；2)基因文库筛选，包括噬菌体文库及酵母菌表达文库，等等；3)，其它生物学方法。但是这些方法很难生产出纯人源化的，高附着力的单抗药物。抗体是由哺乳动物B细胞生成的一类蛋白，能够特异性的识别抗原，被称为“生物导弹”。具有单一抗原识别特性的抗体被称为单克隆抗体(简称单抗)。单抗技术专利技术于上个世纪70年代，单抗制药起始于上个世纪80年代。单抗技术的基础是免疫鼠类动物获取单克隆细胞株，获得的抗体为鼠源抗体。但是，鼠源蛋白不适合作为人类药物，因此就催生了人源化小鼠技术。但是，免疫人源化小鼠产生的是人-鼠合型抗体，作为人类药物仍然有其局限性。怎样生产纯人源的单抗药物是生物制药的新的挑战。人体主要免疫细胞分为T及B细胞，B细胞负责生产单抗蛋白，T细胞负责提供 B细胞生长发育所需要的信号及细胞生长因子。体外培养并直接刺激免疫细胞生产单抗产物的概念最早在 1990年就有报道(In vitro immunization of human B lymphocytes with cultured melanoma cells (SK-MEL 28) Zhang XM, Borrebaeck CA, Human Antibodies Hybridomas. 1990; 1(1): 42_6)。其试验设计的主体可以简单总结为体外混合培养T及B 细胞并导入抗原。该类试验的一个无法回避的难题是大多数的免疫细胞(B细胞)会在大约 2周时间内死亡，以至于试验无法进行下去。一个折中的解决方法是用EBV病毒来改造并转化免疫细胞，以避免细胞死亡。然而，EBV病毒的导入，属于生物污染高危过程，其产生的危害远远大于其正面效果；仅能进行科学实验探索，并不可能应用于生物制药。总体来说，该类试验成功率非常低，几乎不具备可操作性。因此，医药行业需要一种产率高、无生物污染、 操作简单的技术制备纯人源单克隆抗体细胞株，再生产出纯人源单克隆抗体。
技术实现思路
本专利技术提供，该方法将T细胞、B 细胞、人体淋巴结内皮细胞进行共同培养，将特异性的免疫细胞经抗原激活，促进B细胞分裂及增值，从而获得抗原特异性的单克隆抗体细胞株，再获得纯人源单克隆抗体。本专利技术是通过以下技术方案实现的，将T细胞、B细胞、人体淋巴结内皮细胞进行共同培养，将特异性的免疫细胞经抗原激活，促进B细胞分裂及增值，从而获得抗原特异性的单克隆抗体细胞株，再获得纯人源单克隆抗体。 该方法包括以下阶段A、第一阶段细胞体外混合培养及刺激a.筛选注射过乙肝疫苗的健康自愿献血者，采集对乙肝疫苗呈免疫阳性反应的健康自愿献血者的血液样品进行分离提纯处理，得到人体⑶-4 T细胞；b.将所述的人体CD-4T细胞用乙肝疫苗抗原短肽进行激活反应，得到激活的人体 CD-4 T细胞；c.对与A-a步骤中同一乙肝疫苗免疫阳性反应的健康自愿献血者的血液样品进行分离提纯处理，得到人体B细胞；d.对离体的人体淋巴结样品进行分离提纯处理，得到人体淋巴结内皮细胞；e.将所述的激活的人体CD-4T细胞、人体B细胞、人体淋巴结内皮细胞稀释为混合细胞悬液，进行混合培养，并在培养过程中加入抗原进行刺激，得到成熟、增殖的细胞；所述的混合培养的时间为3周； 所述的刺激的方法为将所述的混合细胞悬液按8 mL/每孔的量加入到6孔细胞培养盘内，再加入最终浓度为50-1000 ng/mL的乙肝表面抗原HBsAg ；所述的刺激的时机为在所述的混合培养的第1天进行第一次刺激；在所述的混合培养的第8天进行第二次刺激；所述的混合细胞悬液中，所述的激活人体的CD-4 T细胞、人体B细胞、人体淋巴结内皮细胞的终浓度之比为5:20:0.1;B、第二阶段细胞融合将所述的成熟、增殖的细胞与人用杂交骨髓瘤细胞进行融合处理，得到融合杂交瘤细胞；所述的融合处理采用聚乙二醇诱导； e 融合后培养在所述的融合细胞悬浮液于37°C进行细胞培养的第二天，将培养液换为HT-RPMI1640 培养液，继续进行细胞培养； f 特异性筛选在所述的融合细胞悬浮液于37°C进行细胞培养2-3周，选取培养盘的细胞孔中的上清液进行酶联免疫吸附法筛选，检测该上清液中IgG及IgM浓度；选择IgG浓度高的细胞孔，进行特异性筛选；所述的特异性筛选得到阳性结果的融合细胞即为杂交瘤细胞；将所述的杂交瘤细胞进行大量扩增；C、第三阶段单克隆化将上述扩增的杂交瘤细胞进行单克隆化，得到单克隆细胞株；所述的单克隆化的方法为限制性梯度稀释；D、第四阶段阳性克隆验证在所述的单克隆细胞株于37°C进行细胞培养2-3周后，此时选取培养盘的细胞孔中的上清液进行酶联免疫吸附法筛选，检测培养液中IgG及IgM浓度；选择IgG浓度高的细胞孔，进行特异性筛选，得到阳性结果的即为抗原特异性的单克隆细胞株；3/8页E、第五阶段单克隆抗体生产将所述的抗原特异性的单克隆细胞株再进行扩增后，进行大规模单克隆抗体的生产， 再进行单克隆抗体的分离提纯处理，得到所述的纯人源单克隆抗体。本专利技术相比现有技术具有如下有益效果本专利技术采用的技术为混合细胞培养法，简单易行，操作方便，一步到位，筛选过程简单， 节省大量人力物力；本专利技术单抗生产效率大大提高，融合细胞产生抗体的比例成倍增加； 本专利技术由于细胞在长达3周的培养期内有充分的条件进化成熟，因此本专利技术有更大的把握获得单抗药物的理想类型IgG ；本专利技术的大多数的克隆成功的实现了从IgM到IgG的类型转化，生产IgG型单抗几率大大提高；本专利技术中由于B细胞在刺激及分化，成熟时有良好的环境，有可能在仅仅一个试验周期内获得若干高附着力单抗产物；本专利技术在一个体外培养周期即可生产抗多种抗原的单抗药物，研发效率可以成倍增加；本专利技术可以直接研制100%的纯人源化的单抗产物，不必通过复杂的手段进行转化处理。附图说明图1 实施例1的B-f步骤中，酶联免疫吸附法(ELISA)测定的所述的培养盘的细胞孔中的上清液中的IgG含量。具体实施例方式实施例1本实施例为混合细胞培养生产纯人源单克隆抗体细胞株的方法，所述的纯人源单克隆抗体为乙肝抗体。该方法包括以下阶段细胞体外混合培养及刺激、细胞融合、单克隆化、特异性验证及单克隆抗体生产；A、第一阶段细胞体外混合培养及刺激a.筛选注射过乙肝疫苗的健康自愿献血者，采集对乙肝疫苗呈免疫阳性反应的健康自愿献血者的血液样品进行分离提纯处理，得到人体⑶-4 T细胞；所述的分离提纯采用免疫磁珠分选法，选用CD-4磁珠单抗，所述的CD-4磁珠单抗购自 Miltenyi 公司、BD Biosciences 公司、或 Stem cell technologies 公司；分选的详细步骤参见产品说明；b.将所述的人体CD-4T细胞用乙肝疫苗抗原短肽进行激活反应，得到激活的人体 CD-4 T细胞；所述的乙肝疫苗抗原短肽为preSl 20-47aa，氨基酸序列为WSPQAQGML本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种混合细胞培养生产纯人源单克隆抗体的方法，其特征在于：该方法将Ｔ细胞、Ｂ细胞、人体淋巴结内皮细胞进行共同培养，将特异性的免疫细胞经抗原激活，促进Ｂ细胞分裂及增值，从而获得抗原特异性的单克隆抗体细胞株，再获得纯人源单克隆抗体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：万晓春，姚红，吴洪飞，
申请(专利权)人：万晓春，
类型：发明
国别省市：94