检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的引物和探针、实时荧光定量PCR方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的引物和探针、实时荧光定量PCR方法及试剂盒。该引物和探针包括SalK、virB4-89K、cps2J引物探针序列集。该方法包括选择引物探针序列集、实时荧光定量PCR反应。该试剂盒包括SalK、virB4-89K、cps2J引物探针序列集和其它相关试剂。本发明专利技术的引物和探针、PCR方法及试剂盒可在在很短的时间内确定2型猪链球菌中是否含有89K毒力岛基因，从而为应对疫情争取更多的时间。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的引物和探针、实时荧光定量 PCR方法及试剂盒，属于生物工程

技术介绍
猪链球菌(Sti^ptococcus suis, S. suis)为革兰阳性兼性厌氧球菌，根据荚膜多糖的抗原性，猪链球菌可分为35个血清型，其中1、2、1/2、7、9和14型具有致病性，并以2 型(S. suis 2)毒力最强，临床检出率最高。2型猪链球菌是一种重要的人畜共患传染病病原体，不仅可导致猪急性败血症、脑膜炎、关节炎、心内膜炎及急性死亡，还可通过伤口和呼吸道等传播途径，导致人的感染发病和死亡。2型猪链球菌呈全球性分布，不仅给全世界养猪业造成巨大的经济损失，而且对相关从业人员的健康亦构成严重威胁，已成为重要的新发传染病病原体。2型猪链球菌根据致病力的强弱可分为强毒株，弱毒株或无毒株。然而，弱毒株或无毒株2型猪链球菌在健康猪扁桃体的带菌率可高达42. 6%，这就给病猪诊断和肉品检测带来困难——在检疫检验时，检到2型猪链球菌后还必须鉴定其致病力，进而采取针对性的应对措施，从而防止疫情爆发和蔓延。本专利申请人已针对2型猪链球菌主要毒力因子(CPS2、MRP、EF、Sly)建立了多重常规PCR体系检测2型猪链球菌，并研制出相应的试剂盒，在国内率先提供快速诊断的技术手段(研究成果发表在《中华流行病学杂志》2005年9月第沈卷第九期)。通常，2型猪链球菌在人群中只引起散发的急性脑膜炎和败血症。然而，1998年在江苏省以及2005年在四川省大规模爆发的两起2型猪链球菌感染人的突发公共卫生事件共导致了 240人感染，52人死亡，病人出现链球菌中毒性休克综合征(STSQ的新临床型别， 该型别患病致死率高达80%以上，为历史罕见。本专利申请人率先对来自中毒休克综合症临床病人的1998年江苏分离株 (98HAH12)和2005年四川分离株(0MYH33)分别作了全序列基因测定，经对比分析，在全世界首次发现这两个中国强毒株比欧洲株多出一段89K序列片段，称为89K毒力岛(王长军，A Glimpse of Streptococcal Toxic Shock Syndrome from Comparative Genomics of S. suis 2 Chinese Isolates. PLoS ONE，2007，Issue5，1-9)。本专利申请人在后续研究中发现，该89K毒力岛对菌株毒力因子起到全局性的调控作用(王长军，^activation of Dipeptidyl Peptidase IV Attenuates the Virulence of Streptococcus suis Serotype 2 that Causes Streptococcal Toxic Shock Syndrome. Curr Microbiol，2009，。在敲除89K毒力岛基因后，菌株的致病性显著降低，宿主症状显著改善，存活率显著提高(王长军，SalK/SalR，a Two-Component Signal Transduct ion System, Is Essential for Full Virulence of Highly Invasive Streptococcus suis Serotype 2. PLoS ONE，2008， Volume3，Issue5，1_12)。上述研究表明，89K毒力岛应是这两次流行2型猪链球菌的一种重要致病基因，是引起我国人感染猪链球菌病中毒性休克综合症的关键致病基因。含有89K毒力岛的2型猪链球菌的致病力远远超过传统的强毒株2型猪链球菌， 但目前还没有一种能检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的技术手段，而这种技术手段对于应对由含89K毒力岛2型猪链球菌引起的传染病，特别是在中国突发公共卫生事件中早期应急处置由含89K毒力岛2型猪链球菌导致的疫情，进而抑制疫情爆发和蔓延具有重要的眉、ο
技术实现思路
本专利技术的第一目的是针对现有技术存在的问题，提供一种检测2型猪链球菌89K 毒力岛基因的引物和探针。本专利技术的第二目的是提供一种检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的实时荧光定量PCR方法。本专利技术的第三目的是提供一种检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的试剂盒。申请人:经研究发现，2型猪链球菌89K毒力岛的二元信号转导系统基因MlK和IV 型分泌系统毒力基因virB4-89K均对2型猪链球菌的致病力起到关键的调节作用。结合上述研究发现，实现本专利技术第一目的的技术方案如下一种检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的引物和探针，其特征是，包括由引物对 SalK-F和&11K-R、及探针MlK-probe组成的&ι1Κ引物探针序列集；其中，引物&ilK_F的序列如SEQ ID No. 1所示，引物SalK-R的序列如SEQ ID No. 2所示，探针SalK-probe的序列如SEQ ID No. 3所示；所述探针SalK-probe的5'端标记有报告荧光基团、3'端标记有淬灭荧光基团；所述报告荧光基团选自FAM、J0E、Cy3、Cy5、TRAMA、TET、R0X、HEX之一，所述淬灭荧光基团为BHQ、ECLIPSE之一。进一步地，还包括由引物对virB4-89K-F和virB4_89K_R、及探针 virB4-89K-probe组成的virB4_89K引物探针序列集，和/或由引物对cps2J_F和cps2J-R、 及探针cps2J-probe组成的cps2J引物探针序列集；其中，引物virB4_89K_F的序列如SEQ ID No. 4所示，引物virB4H-R的序列如SEQ ID No. 5所示，探针virB4_89K-probe的序列如SEQ ID No. 6所示；引物cps2J-F的序列如SEQ ID No. 7所示，引物cps2J-R的序列如SEQ ID No. 8 所示，探针 cps2J-probe 的序列如 SEQ ID No. 9 所示；所述探针 virB4_89K-probe、 探针cpS2J-probe的5'端标记有报告荧光基团、3'端标记有淬灭荧光基团。2型猪链球菌普遍含有基因cps2J，采用cps2J引物探针序列集可以确认2型猪链球菌。采用上述引物和探针进行实时荧光定量PCR反应，即可快速确定2型猪链球菌中是否含有89K毒力岛基因。实现本专利技术第二目的的技术方案如下一种检测2型猪链球菌89K毒力岛基因的实时荧光定量PCR方法，其特征是，包括以下步骤(1)选择引物探针序列集选择由SEQ ID No. 1-3组成的MlK引物探针序列集； 其中，探针MlK-probe的5'端标记有报告荧光基团、3‘端标记有淬灭荧光基团；所述报告荧光基团选自FAM、JOE、Cy3、Cy5、TRAMA, ΤΕΤ、ROX, HEX之一，所述淬灭荧光基团为BHQ、ECLIPSE 之一；(2)实时荧光定量PCR反应以待测样品的基因组DNA为扩增模板，根据所选引物探针序列集的探针上所标记的报告荧光基团选择荧光通道，利用所选引物探针序列集的引物对和探针进行实时荧光定量PCR反应，同时记录荧光曲线和扩增循环数CT ；其中，所述2型猪链球菌89K毒力岛的基因MlK的阳性判本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种检测２型猪链球菌８９Ｋ毒力岛基因的引物和探针，其特征是，包括由引物对ＳａｌＫ－Ｆ和ＳａｌＫ－Ｒ、及探针ＳａｌＫ－ｐｒｏｂｅ组成的ＳａｌＫ引物探针序列集；其中，引物ＳａｌＫ－Ｆ的序列如ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．１所示，引物ＳａｌＫ－Ｒ的序列如ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．２所示，探针ＳａｌＫ－ｐｒｏｂｅ的序列如ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．３所示；所述探针ＳａｌＫ－ｐｒｏｂｅ的５′端标记有报告荧光基团、３′端标记有淬灭荧光基团；所述报告荧光基团选自ＦＡＭ、ＪＯＥ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＴＲＡＭＡ、ＴＥＴ、ＲＯＸ、ＨＥＸ之一，所述淬灭荧光基团为ＢＨＱ、ＥＣＬＩＰＳＥ之一。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王长军，朱静，张锦海，胡丹，潘秀珍，唐家琦，
申请(专利权)人：中国人民解放军南京军区军事医学研究所，
类型：发明
国别省市：84