本发明专利技术公开了检测洋葱腐烂病菌的核苷酸序列和试剂盒，属于植物检验检疫领域。检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR检测引物，为序列表SEQIDNo.1和SEQIDNo.2的寡核苷酸序列。本发明专利技术的优点是：通过本发明专利技术建立的实时荧光定量PCR检测方法和试剂盒能够特异、灵敏、快速地检出洋葱腐烂病菌。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及检测洋葱腐烂病菌的核苷酸序列和试剂盒，属于植物检验检疫领域。
技术介绍
洋葱腐烂病菌QBurkholderia gladioli ρ v. aWiicoh )隶属于原核生物界 (Procaryoces)、薄壁菌门(Gracilicutes)、肠杆菌禾斗(Enterobacteriaceae)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、唐菖蒲伯克霍尔德菌(Murkholderia gladioli )。唐菖蒲伯克霍尔德嵬〔Burkholderia gladioli)是一种引起唐菖蒲球茎腐烂的病原菌，Severini在 1913年的文献中最早描述了这种病原菌，并将其命名为作洲而膨/？浙gladioli 0 1992 ip，Pseudomonas gladioli 与胃它7^{同属于fiUfi 属(.Pseudomonas) rRNA Group II的菌种一起被划分到了一个新属——伯克霍尔德菌属Ofcrf^Aferia),从而被命名为 Burkholderia gladioli 。洋葱腐烂病菌最初只是被当成一种植物病原菌。寄主植物主要是葱属植物 {Allium c^a )和郁金香属(TWiA3 spp.)。主要致病症状是鳞茎的内部鳞片腐烂，初期外观看不到症状，但后期整个鳞茎变软，可看到大量细菌分泌物。在叶片上也可产生干燥的坏死斑。洋葱腐烂病菌侵染洋葱叶片后，一到两片叶片会枯萎变白，并且脱落，病原菌由叶片再侵染至球茎。受侵染的洋葱鳞球茎，先期外部无明显特征，只在鳞球茎颈部出现腐烂，剖开后，发现内部一到两个小鳞茎已呈水浸状。后期肉质鳞状组织出现水浸状，由白黄色变为浅褐色，逐渐腐烂变软，在病害发病后期会有粘性、腐烂难闻液体流出，直至整个球茎变干、 枯萎。田间发病率可达到89.1 %。传播途径包括带菌种子、鳞球茎，土壤等。1985 年，Christenson ^Μ ΜΙ Burkholderia gladioli 感染囊性纤维化(CF， Cistic Fibrosis)病人呼吸道的病例。接着，陆续在慢性肉芽肿和免疫功能减弱的病人体 RM7 Burkholderia gladioli. Burkholderia gladioli 感染的病症还包括败血病、脓肿、骨髓炎、角膜炎和淋巴腺炎。^zr姑Weria gladioli可能主要导致CF病人的急性感染以及肺移植术后的血液感染，目前还没有^zr姑Weria ^/ai/iWi在病人与病人之间传播的报道。洋葱腐烂病菌是引起洋葱腐烂的高风险检疫性病菌，其准确检测和鉴定在检验检疫工作中具有重要意义。鉴于我国目前没有洋葱腐烂病的发生危害报道，为了减少境外洋葱腐烂病菌传入的风险、保护公众健康，本专利技术研究开发出一种特异的洋葱腐烂病菌检测技术。
技术实现思路
本专利技术要解决的第一个技术问题是提供检测洋葱腐烂病菌的核苷酸序列。本专利技术要解决的另一个技术问题是提供检测洋葱腐烂病菌的试剂盒。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR检测引物，为序列表SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2的寡核苷酸序列。检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR探针，为序列表SEQ ID No. 3的寡核苷酸序列。所述探针的5’端连接荧光报告基团FAM，3’端连接荧光淬灭基团BHQ1。本专利技术根据NCBI 数据库中 Burkholderia gladioli pv. alliicola ITS 基因序列保守区，设计并经大量筛选得到最佳引物和探针。探针5'端标记报告荧光染料 6-Carboxy fluorescein (FAM)，3'端标记淬灭荧光染料BHQl。引物和探针由宝生物工程有限公司合成。上游引物 PBAF:5' - GCTTCCGCTATCCAAATTACTACTTC -3' (SEQ ID No. 1)； 下游引物 PBAR:5' - ATGACAAATGTTCGAGTCAGTTGAC -3' (SEQ ID No. 2);探针为FAM_AT TGTTAAAGAACGACAGCCGATAAGCACAC-BHQ1 (SEQ ID No. 3)。检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒含有检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR检测引物和检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR探针；所述检测引物为序列表SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2的寡核苷酸序列，所述探针为序列表SEQ ID No. 3的寡核苷酸序列，探针的5’端连接荧光报告基团FAM，3’端连接荧光淬灭基团BHQ1。一种检测洋葱腐烂病菌的试剂盒，由以下组分组成(1)PCR反应液由2X反应液I^remixEX Taq、引物PBAF、引物PBAR和探针组成；反应液I^remix EX Taq的终浓度为1 X，引物PBAF的终浓度为0. 3uM、引物PBAR的终浓度为 0. 3uM，探针的终浓度为0. IuM ；2 X反应液I^remix EX Taq购于Takara公司；引物和探针均委托iTakara公司合成，其中，引物PBAF (引物1)为序列表SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，引物PBAR (引物2)为序列表SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，探针为序列表SEQ ID N0. 3所示的核苷酸序列，探针 5'端标记报告荧光染料6-Carboxy fluorescein (FAM)，3'端标记淬灭荧光染料BHQl ；(2)无DNA酶的灭菌纯化水用自来水两次蒸馏，经过MilliporeMILLI-Q PF PLUS纯水仪纯化，收取电阻率彡18. 0ΜΩ. cm的水，贮于无菌瓶中。Millipore -Q纯化水151bf/ in2(1.034X 105Pa)高压蒸汽灭菌15分钟；(3)阴性对照lmLX1管；研磨无菌健康洋葱鳞球茎，用0. 01mol/L pH7. 2 PBS缓冲盐溶液制成20%悬液，121°C灭活30min ；(4)阳性对照=ImLXl管；为含有洋葱腐烂病菌ifea核糖体基因保守区序列(SEQID N0. 4)的重组质粒，Ct值为22. 0 沘.0。阳性对照的制备方法为用SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的引物序列对洋葱腐烂病菌进行PCR反应，回收PCR扩增产物，获得高纯度的138 bp核糖体基因保守区序列(SEQ ID No. 4)，与pGEM-T easy载体(购自Promega公司)进行连接，转化Ε. coli Competent Cells DH5 α 感受态细胞(购自 Promega 公司)，使用 Takara MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver 2. O (购自TaKafci公司)质粒提取试剂盒提取DNA，经PCR和酶切鉴定后获得阳性重组质粒作为阳性对照，命名为pGEM-Bga。10倍连续梯度稀释裂解液，测定Ct值，Ct值为22. O 观.O均可作为阳性对照。核糖体基因保守区序列如下(SEQ ID No. 4): ATGACAAATGTTCGAGTCAGTTGACTCGAGTCTTTGTCATTGGCGATTGAGCCAGTCAGAGTGATGAGTACACAAGTGTGCTTATCGGCTG本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．检测洋葱腐烂病菌的荧光定量ＰＣＲ检测引物，其特征在于：为序列表ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１和ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２的寡核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：高文娜，王中康，周琦，黄魁建，汪万春，李建光，李子龙，江丽辉，吕玉峰，边勇，王文静，邓丛良，梁新苗，
申请(专利权)人：北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：11
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