同时适于七个转基因油菜品系特异性检测的标准分子制造技术

本发明专利技术涉及同时适于七个转基因油菜品系特异性检测的标准分子。构建了同时适于转基因油菜RT73品系、MS1×RF1品系、MS1×RF2品系、MS8×RF3品系、T45品系、Oxy235品系和/或Topas19/2品系特异性检测的通用型标准分子，对所述标准分子在定性和定量检测中的适用性进行验证表明，所述的标准分子高度特异于上述转基因油菜品系的检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
；更具体地，本专利技术涉及同时适于七个转基因油菜品系特异性检测的标准分子。
技术介绍
近年来，转基因生物技术在农业生产中得到广泛应用，世界各国正在不断完善转基因生物的检测方法研究，加强对转基因原料及其产品的安全监督。其中核酸检测技术已成为转基因生物检测的最主要和常用的方法。在现有技术条件下外源基因是以随机的方式插入作物基因组的，因此每个转基因作物品种中外源插入片段与作物基因组DNA结合位点的边界序列应该是唯一的，根据边界序列设计引物，从而可以鉴定出转基因作物的品系，即品系特异性检测。然而，不论采用基于核酸或蛋白质的方法，在转基因检测时均必须使用标准物质 (Reference materials)作为阳性对照或制作标准曲线，以对转基因产品进行准确检测。标准分子(Reference molecule)是一种重组质粒分子，其一般包含转基因作物检测的外源基因或品系特异性片段以及物种特异性片段。由于操作简便、生产成本低、容易获得高纯度和高浓度DNA样品。近年来标准分子被认为是解决转基因作物检测标准物质缺乏的有效途径之一，已作为新型DNA标准物质用于转基因作物检测和定量分析。目前，全世界已有20多个转基因油菜品系进入商业化种植，其中孟山都公司的抗草甘磷品系RT73(GT73)和拜耳公司的6个抗除草剂品系(MS8XRF3，MS1 XRF1，MS1 XRF2， 0xy235, Topas 19/2和T45)于2004年3月通过我国农业部的安全性评估并获得加工原料进口许可。迄今为止，还没有同时将以上7种转基因油菜品系外源基因构建标准分子的报道。为了给中国转基因油菜品系监管提供必要的技术支撑，以及为了简化多种转基因油菜品系的检测，有必要开发适于多种转基因油菜品系特异性检测的、稳定可靠的通用型标准分子。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供可满足多种转基因油菜品系特异性检测的、稳定可靠的通用型标准分子。在本专利技术的第一方面，提供一种重组质粒，其包含(较佳地为5’ 一 3’)以下序列片段MSl 5，端品系特异性序列(MS1-5) ；RT73 3，端品系特异性序列(RT73-3) ；RF33，端品系特异性序列(RF3-3) ；MS8 3’端品系特异性序列(MS8-3) ；0xy235 5’端品系特异性序列(0XY235-5) ；MS8 5，端品系特异性序列(MS8-5) ；RF3 5，端品系特异性序列(RF3-5)； T45 5，端品系特异性序列(T45-5) ；Topasl9/2 3，端品系特异性序列(Topas) ；RF2 5，端品系特异性序列(RF2-5) ；0xy235 3’端品系特异性序列(0XY235-3) ；RFl 5’端品系特异性序列(RF1-5)；油菜内源标准基因HMG序列片段；油菜内源标准基因PEP序列片段。在另一优选例中，所述的RFl 5’端品系特异性序列(RF1-5)与MSl 5’端品系特异性序列(MS1-5)之间距离大于2000bp ；或所述的RF25’端品系特异性序列反向连接入重组质粒中。在另一优选例中，所述的MSl 5，端品系特异性序列(MS1-5)如SEQ ID N0:1所示；所述的RT73 3，端品系特异性序列(RT73-3)如SEQ ID NO 2所示；所述的RF33， 端品系特异性序列(RF3-3)如SEQ ID NO :3所示；所述的MS8 3，端品系特异性序列 (MS8-3)如SEQ ID NO :4所示；所述的0xy235 5，端品系特异性序列(0XY235-5)如SEQ ID NO :5所示；所述的MS8 5，端品系特异性序列(MS8-5)如SEQ ID NO :6所示；所述的RF3 5， 端品系特异性序列(RF3-5)如SEQ ID N0:7所示；所述的T455，端品系特异性序列(T45-5) 如SEQ ID N0:8所示；所述的Topasl9/2 3’端品系特异性序列(Topas)如SEQ ID NO 9 所示；反向的RF2 5，端品系特异性序列(RF2-5)如SEQ ID NO 10所示；所述的0xy235 3， 端品系特异性序列(0XY235-3)如SEQ IDNO 11所示；或所述的RFl 5，端品系特异性序列 (RF1-5)如 SEQ ID NO 12 所示。在另一优选例中，所述的油菜内源标准基因HMG序列片段如SEQ ID NO 13所示； 或所述的油菜内源标准基因PEP序列片段如SEQ ID N0:14所示。在另一优选例中，所述的重组质粒中还包括来源于动物⑶C37的基因片段。在另一优选例中，所述的来源于动物⑶C37的基因片段如SEQ ID NO 15所示。在另一优选例中，所述的重组质粒的大小为7000_10000bp。在另一优选例中，所述的重组质粒的大小为7500_8500bp。在另一优选例中，所述的重组质粒的骨架质粒是pEASY-T3载体。在本专利技术的另一方面，提供所述的重组质粒的用途，用于作为标准分子，检测转基因油菜RT73品系、MSl X RFl品系、MS1XRF2品系、MS8XRF3品系、T45品系、0xy235品系和/或Topas 19/2品系。在另一优选例中，所述的标准分子是通用型标准分子。在本专利技术的另一方面，提供一种检测转基因油菜RT73品系、MS1XRF1品系、 MS1XRF2品系、MS8XRF3品系、T45品系、0xy235品系和/或TopasWA品系的方法，所述方法包括以所述的重组质粒为标准分子，测定待测油菜样品中相应的转基因油菜RT73品系、MS1XRF1 品系、MS1XRF2 品系、MS8XRF3 品系、T45 品系、0xy235 品系或 Topasl9/2 品系特异性序列的存在与否以及存在量；若待测油菜样品中存在RT73 3’端品系特异性序列，则表明该样品含有RT73品系；若待测油菜样品中存在MSl 5’端品系特异性序列以及存在RFl 5’端品系特异性序列，则表明该样品含有MSl XRFl品系；若待测油菜样品中存在MSl 5’端品系特异性序列以及存在RF2 5’端品系特异性序列，则表明该样品含有MSl X RF2品系；若待测油菜样品中存在MS8 3’端品系特异性序列和/或5’端品系特异性序列，以及存在RF3 3’端品系特异性序列和/或5’端品系特异性序列，则表明该样品含有MS8XRF3 品系；5若待测油菜样品中存在T45 5’端品系特异性序列，则表明该样品含有T45品系；若待测油菜样品中存在0xy235 5’端品系特异性序列和/或3’端品系特异性序列，则表明该样品含有0xy235品系；若待测油菜样品中存在TopaS19/2 3’端品系特异性序列，则表明该样品含有 Topasl9/2 品系。在另一优选例中，采用PCR的方法扩增待测油菜或其来源样品中MS1 5’端品系特异性序列(MS1-5) ；RT73 3’端品系特异性序列(RT73-3) ；RF3 3’端品系特异性序列 (RF3-3) ；MS8 3，端品系特异性序列(MS8-3) ；0xy235 5，端品系特异性序列(0XY235-5)； MS8 5，端品系特异性序列(MS8-5) ；RF3 5，端品系特异性序列(RF3-5) ；T45 5，端品系特异性序列(T45-本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种重组质粒，其特征在于，其包含以下序列片段：ＭＳ１　５’端品系特异性序列；ＲＴ７３　３’端品系特异性序列；ＲＦ３　３’端品系特异性序列；ＭＳ８　３’端品系特异性序列；Ｏｘｙ２３５　５’端品系特异性序列；ＭＳ８　５’端品系特异性序列；ＲＦ３　５’端品系特异性序列；Ｔ４５　５’端品系特异性序列；Ｔｏｐａｓ１９／２　３’端品系特异性序列；ＲＦ２　５’端品系特异性序列；Ｏｘｙ２３５　３’端品系特异性序列；ＲＦ１　５’端品系特异性序列；油菜内源标准基因ＨＭＧ序列片段；油菜内源标准基因ＰＥＰ序列片段。

【技术特征摘要】
1.一种重组质粒，其特征在于，其包含以下序列片段:MSl 5’端品系特异性序列；RT73 3’端品系特异性序列；RF3 3’端品系特异性序列；MS8 3’端品系特异性序列；0xy235 5’端品系特异性序列；MS8 5’端品系特异性序列；RF3 5’端品系特异性序列；T45 5’端品系特异性序列；TopaS19/2 3’端品系特异性序列；RF2 5’端品系特异性序列；0xy235 3’端品系特异性序列；RFl 5’端品系特异性序列；油菜内源标准基因HMG序列片段；油菜内源标准基因PEP序列片段。2.如权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述的RFl5’端品系特异性序列与MSl 5’端品系特异性序列之间距离大于2000bp ；或所述的RF2 5’端品系特异性序列反向连接入重组质粒中。3.如权利要求1或2所述的重组质粒，其特征在于，所述的MSl 5，端品系特异性序列(MS 1-5)如SEQ ID NO 1所示； 所述的RT73 3，端品系特异性序列(RT73-3)如SEQ ID NO 2所示； 所述的RF3 3，端品系特异性序列(RF3-3)如SEQ ID NO 3所示； 所述的MS8 3，端品系特异性序列(MS8-3)如SEQ ID NO 4所示； 所述的0xy235 5，端品系特异性序列(0XY235-5)如SEQ ID NO 5所示； 所述的MS8 5，端品系特异性序列(MS8-5)如SEQ ID NO 6所示； 所述的RF3 5，端品系特异性序列(RF3-5)如SEQ ID NO 7所示； 所述的T45 5，端品系特异性序列(T45-5)如SEQ ID NO 8所示； 所述的Topasl9/2 3，端品系特异性序列(Topas)如SEQ ID NO 9所示； 反向的RF2 5，端品系特异性序列(RF2-5)如SEQ ID NO 10所示； 所述的0xy235 3，端品系特异性序列(0XY235-3)如SEQ ID NO 11所示；或所述的RFl 5，端品系特异性序列(RF1-5)如SEQ ID NO 12所示。4.如权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述的油菜内源标准基因HMG序列片段如SEQ ID NO 13所示；或所述的油菜内源标准基因PEP序列片段如SEQ ID N0:14所示。5.如权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒中还包括来源于动物 ⑶C37的基因片段。6.如权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒的大小为 7000-10000bp。7.权利要求1-6任一所述的重组质粒的用途，用于作为标准分子，检测转基因油菜 RT73品系、MSl X RFl品系、M...

【专利技术属性】
技术研发人员：李想，潘良文，吕蓉，高琴，刘月明，张舒亚，
申请(专利权)人：中华人民共和国上海出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：31