本发明专利技术属于细胞生物学领域，涉及一种诱导人脐带间充质干细胞分化为类许旺细胞的方法。其包括步骤为：(1)将脐带间充质干细胞培养至亚融合状态后，弃去旧的培养液，加入含有1mM?β-巯基乙醇培养液诱导过夜；(2)弃去诱导液，用DMEM培养基清洗，加入全反式维甲酸诱导60-84小时；(3)弃去诱导液，用DMEM培养基清洗，加入含有5ng/ml-6ng/ml血小板源生长因子、9-10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、13μM-15μM福司柯林以及250-260ng/ml胶质细胞生长因子或200-210ng/ml神经生长因子的复合诱导液，诱导10-16天，每72小时换一次液。本发明专利技术的方法诱导率可达到90％以上。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞生物学领域，涉及细胞诱导分化方法。具体涉及一种快速诱导人脐带间充原干细胞分化为类许旺细胞的方法。
技术介绍
随着组织工程人工神经的研究不断深入，人工可吸收材料的研究已经渐趋成熟， 但是制约组织工程发展的主要瓶颈——种子细胞短缺，越来越突出。以前构建组织工程人工神经主要是利用许旺细胞，但是许旺细胞是终末分化细胞，增殖能力差，成年人的许旺细胞增殖能力更差，需要体外或体内预变性，费时，费力，难于在短时间内获得充足的许旺细胞以构建组织工程神经。另外，人的许旺细胞来源非常的局限，异体来源存在免疫排异，而自体取材，会带来新的创伤，给供区带来感觉异常。所以寻找一种新的细胞治疗或组织工程神经种子细胞的来源非常的迫切，必要。因为干细胞具有强大的自我增殖，扩增能力，且可以多项分化为类许旺细胞，所以成为组织工程神经种子细胞的新来源。目前已经有报道，胚胎干细胞，神经干细胞，骨髓间充质干细胞，脂肪干细胞等诱导分化为类许旺细胞的报道，但是胚胎干细胞和神经干细胞存在干细胞残留，伦理等问题， 而骨髓间充质干细胞和脂肪干细胞取材会给病人带来新的创伤，所以其应用都受到一定的局限。脐带间充质干，是从胎儿废弃物，脐带中分离获得的干细胞，具有强大的自我增殖能力，稳定扩增80代不发生变化，比骨髓间充质干细胞具有更大的增殖能力，同时具有多项分化潜能，已经证明可以诱导分化为骨、软骨、脂肪、神经元等细胞，是介于胚胎干细胞和成体干细胞之间的干细胞，但是向类许旺细胞诱导分化尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种人脐带间充质干细胞诱导分化为类许旺细胞的方法。本专利技术采用采用巯基乙醇、全反式维甲酸、细胞生长因子分步诱导分化的方法在短时间内诱导人脐带间充质干细胞分化为类许旺细胞。本专利技术提供了一种高效诱导人脐带间充质干细胞分化为类许旺细胞的方法，该方法包括下述步骤(1)将脐带间充质干细胞培养至亚融合状态后，弃去旧的培养液，加入含有ImM β-巯基乙醇培养液诱导过夜；(2)弃去步骤⑴所述含有β -巯基乙醇的诱导液，用DMEM培养基清洗，加入全反式维甲酸诱导60-84小时；(3)弃去步骤(2)所述含有全反式维甲酸的诱导液，用DMEM培养基清洗，加入含有 5ng/ml-6ng/ml血小板源生长因子、9_10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、13 μ Μ-15 μ M福司柯林、250-260ng/ml胶质细胞生长因子或200-210ng/ml神经生长因子的复合诱导液，诱导10-16天，每72小时换一次液。所述步骤(1)中，β -巯基乙醇诱导时间为20-Μ小时。所述步骤⑵和(3)中，DMEM培养基清洗2-5次。所述诱导液即在常规培养基中加入诱导分化因子而成。所述步骤O)中，全反式维甲酸的浓度是35ng/ml。所述步骤(2)中，RA的诱导时间是72小时。所述步骤(3)中，血小板源生长因子的浓度是5ng/ml。所述步骤(3)中，碱性成纤维细胞生长因子的浓度是lOng/ml。所述步骤(3)中，福司柯林的浓度是14 μ M。所述步骤(3)中，胶质细胞生长因子的浓度是252ng/ml。所述步骤(3)中，神经生长因子的浓度是200ng/ml。所述步骤(3)中，复合诱导液即在常规培养基中加入血小板源生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、福司柯林、胶质细胞生长因子或神经生长因子，可以含有5ng/ml-6ng/ ml血小板源生长因子、9-10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、13 μ Μ_15 μ M福司柯林、 250-260ng/ml胶质细胞生长因子或200-210ng/ml神经生长因子的中的一种或者几种，所用浓度可以根据具体情况调整。本专利技术的方法中，除特别指出，所用操作均为本领域的常规操作，所用试剂、设备为市售商品。本专利技术将脐带间充质干细胞通过β-巯基乙醇、全反式维甲酸、细胞生长因子等诱导剂诱导获得了类许旺细胞，其诱导率达到90%以上，经过诱导后，细胞表达许旺细胞特异性标记，S100，P75等特异性标记。同时也做了分子生物学的检测，发现细胞的S100.P75， GFAP也上调。说明本专利技术的方法是一种有效地诱导脐带间充质干细胞分化为类许旺细胞的方法。附图说明图1是培养得到的类许旺细胞镜下图。 具体实施例方式实施例1高效诱导人脐带间充质干细胞分化为类许旺细胞的方法操作步骤如下(1)将脐带间充质干细胞培养至亚融合状态后，弃去旧的培养液，加入含有ImM β -巯基乙醇培养液诱导M小时；(2)弃去步骤(1)所述诱导液，用DMEM培养基清洗三次，加入含有35ng/ml全反式维甲酸(RA)诱导72小时；(3)弃去步骤(2)所述诱导液，用DMEM培养基清洗三次，加入复合诱导液[由 5ng/ml血小板源生长因子(PDGF)、10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、14 μ M福司柯林(forskolin，FSK)、252ng/ml胶质细胞生长因子(GGF-幻或200ng/ml神经生长因子 (heregulin-betal, HRG)]诱导 2 周，每 72 小时换一次液。通过上述3个步骤诱导，就可将脐带间充质干细胞诱导分化为类许旺细胞。具体结果见图1。本专利技术高效诱导人脐带间充质干细胞分化为类许旺细胞，诱导率达到90%以上，4经过诱导后，细胞表达许旺细胞特异性标记，S100, P75等特异性标记。同时也做了分子生物学的检测，发现细胞的S100.P75，GFAP也上调！说明本专利技术的方法是一种有效地诱导脐带间充质干细胞分化为类许旺细胞的方法。实施例2高效诱导人脐带间充质干细胞分化为类许旺细胞的方法操作步骤如下(1)将脐带间充质干细胞培养至亚融合状态后，弃去旧的培养液，加入含有ImM β -巯基乙醇培养液诱导20小时；(2)弃去步骤(1)所述诱导液，用DMEM培养基清洗三次，加入含有35ng/ml全反式维甲酸(RA)诱导60小时；(3)弃去步骤(2)所述诱导液，用DMEM培养基清洗2次，加入复合诱导液[由 6ng/ml血小板源生长因子(PDGF)、9/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、13 μ M福司柯林(forskolin，FSK)、260ng/ml胶质细胞生长因子(GGF-2)或210ng/ml神经生长因子 (heregulin-betal, HRG)]诱导 10 天，每 72 小时换一次液。通过上述3个步骤诱导，就可将脐带间充质干细胞诱导分化为类许旺细胞。具体结果如图1所示。本专利技术高效诱导人脐带间充质干细胞分化为类许旺细胞，诱导率达到90%以上， 经过诱导后，细胞表达许旺细胞特异性标记，S100, P75等特异性标记。同时也做了分子生物学的检测，发现细胞的S100.P75，GFAP也上调！说明本专利技术的方法是一种有效地诱导脐带间充质干细胞分化为类许旺细胞的方法。本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种高效诱导人脐带间充质干细胞分化为类许旺细胞的方法，其特征是，该方法包括下述步骤：（１）将脐带间充质干细胞培养至亚融合状态后，弃去旧的培养液，加入含有１ｍＭβ－巯基乙醇培养液诱导过夜；（２）弃去步骤（１）所述诱导液，用ＤＭＥＭ培养基清洗，加入全反式维甲酸诱导６０－８４小时；（３）弃去步骤（２）所述诱导液，用ＤＭＥＭ培养基清洗，加入含有５ｎｇ／ｍｌ－６ｎｇ／ｍｌ血小板源生长因子、９－１０ｎｇ／ｍｌ碱性成纤维细胞生长因子、１３μＭ－１５μＭ福司柯林以及２５０－２６０ｎｇ／ｍｌ胶质细胞生长因子或２００－２１０ｎｇ／ｍｌ神经生长因子的复合诱导液，诱导１０－１６天，每７２小时换一次液。
【技术特征摘要】
1.一种高效诱导人脐带间充质干细胞分化为类许旺细胞的方法，其特征是，该方法包括下述步骤(1)将脐带间充质干细胞培养至亚融合状态后，弃去旧的培养液，加入含有ΙπιΜβ-巯基乙醇培养液诱导过夜；(2)弃去步骤(1)所述诱导液，用DMEM培养基清洗，加入全反式维甲酸诱导60-84小时；(3)弃去步骤( 所述诱导液，用DMEM培养基清洗，加入含有5ng/ml-6ng/ml血小板源生长因子、9-10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、13 μ Μ-15 μ M福司柯林以及250460ng/ml 胶质细胞生长因子或200-210ng/ml神经生长因子的复合诱导液，诱导10-16天，每72小时换一次液。2.根据权利要求1所述的方法，其特征是步骤⑴中巯基乙醇诱导时间为20-M 小时。3.根据权...
【专利技术属性】
技术研发人员：沈尊理，秦金保，祝加学，
申请(专利权)人：上海市第一人民医院，
类型：发明
国别省市：31
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