一种通过胚性细胞组织制备蛋白质的方法技术

本发明专利技术提供一种通过胚性细胞组织制备蛋白质的方法。所述方法是通过将含有需要制备的蛋白质基因转化到植物胚性细胞中进行培养来制备蛋白质的，具体包括1)制备植物胚性细胞组织；2)将需要制备的蛋白质基因转入步骤1)所制备的胚性细胞组织中；3)培养步骤2)得到的胚性细胞组织，使其发育成熟为体细胞胚；4)从步骤3)得到的体细胞胚中提取蛋白质。用于制备蛋白质的胚性细胞组织为针叶类植物的胚性细胞组织。本发明专利技术所提供的方法是制备转基因药用蛋白的一个重大改革，能显著提高转基因药用蛋白产率，适合于放大生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种制备蛋白质的方法，具体地，本专利技术涉及一种通过胚性细胞组织 制备蛋白质的方法。
技术介绍
已证明转基因植物种子合子胚是药用活性蛋白的极佳来源(Hood etal。2003， Horn et al。2004)，其原因包括胚胎中高蛋白含量，天然拥有蛋白酶抑制剂，且在成熟的种 子中能降低总体代谢活动，并能导致外源蛋白保持长期稳定性的低水份含量。大规模生产 药用蛋白要求转基因作物种植在开放的田间，因为大棚种植昂贵因而受到局限。在开放的 田间种植此类作物要求政府统一集中监测和批准，而且对于转基因产品的可能逃脱监管区 域而进入到食物链还存在极大的争议.对此的解决办法是在大型生物发酵罐中通过细胞悬浮培养液形式生长转基因植 物细胞或组织。这种解决办法有许多优点(Hellwig et al。2004)。这些优点是(1)从接 种，收成到过程处理完全在密封的容器中进行；(2)气候和季节不构成影响产量的因素，这 意味着药用蛋白质的生产可周年进行；(3)处理废弃生物质简单且便宜；(4)发酵罐生物反 应器系统对制药企业来讲比田间生产系统更容易被接受；(5)商用转基因生产系可以采用 细胞库，采用低温贮藏办法。但是，生物反应器系统生长转基因植物细胞用于生产异性蛋白，特别是药用蛋白 的可见的弱点在于(1)从历史角度看，产率低(Hellwig etal. 2004)，(2)使用较小规模生 物反应器所带来的较高的成本(Hood et al,2003) ； (3)必须马上处理，因为不可以放置较 长时间。因此，本专利技术寻求对这些问题的解决并改进制备蛋白质的方法。 专利技术内容除非特别说明，在本文中，所使用的术语“胚性细胞组织”或“胚性体细胞组织”，是 指还没有形成胚胎器官如双极胚胎结构(可分化幼苗和根部)以及子叶(子叶可能是或不 是某个特定植物种类胚胎器官组成部分)的细胞组织。除非特别说明，在本文中，所使用的术语“体细胞胚”，简称“体胚”，是指胚性体细 胞在培养液中生长发育一段时间后形成的物质，其可能形成不了成熟的具有器官或类似器 官结构的胚胎，如子叶或胚根，但却仍然具有成熟器官的特性，即蛋白含量高，具有蛋白酶 抑制剂，干物质含量高和水份含量低，并能使外源蛋白保持长期稳定。本专利技术的目的在于，提供。本专利技术的另一个目的在于，提供用于制备蛋白质的胚性细胞组织。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的。一方面，本专利技术提供一种制备蛋白 质的方法，所述方法是通过将含有需要制备的蛋白质基因转化到植物胚性细胞组织中进行 培养来制备蛋白质的。优选地，所述方法包括以下步骤1)制备植物胚性细胞组织；幻将需要制备的蛋 白质基因转入步骤1)所制备的胚性细胞组织中；；3)培养步骤幻得到的胚性细胞组织，使 其发育成熟为体细胞胚；4)从步骤幻得到的体细胞胚中提取蛋白质。优选地，所述步骤1)中制备植物胚性细胞组织的方法包括采用半固体培养基 诱导和液体培养基增殖的步骤；优选地，所述培养基为添加了 1_2(^!1101/1生长素和/ 或l-20ymol/L细胞分裂素的1/2 Litvay(LV)培养基；更优选地，所述的培养条件为 20-300C，黑暗，90-120转/分钟摇床培养。优选地，所述步骤幻中将需要制备的蛋白质基因转入胚性细胞组织的方法选自 微粒-介导传递技术(基因枪转化)、原生质电穿孔方法、聚乙二醇析出技术、直接基因转移 技术、生物体外原生质转化技术、植物细胞原生质或胚性愈伤组织显微注射技术和土壤农 杆菌转化方法；更优选地，所述步骤2、中是通过微粒-介导传递技术和土壤农杆菌转化方 法将需要制备的蛋白质基因转入胚性细胞组织。优选地，所述步骤2、中获得的转基因胚性细胞组织是通过超低温液氮冷冻技术 并以细胞库的方式保存，转基因胚性细胞组织的细胞先被制作成种源细胞库(master cell bank，MCB)，然后用种源细胞库的细胞制作工作细胞库(working cell bank, WCB) 0优选地，所述方法还包括在超低温下冷冻保藏所述步骤1)中制备的胚性细胞组 织或步骤幻中制备的转入蛋白质基因的胚性细胞组织的步骤；更优选地，所述冷冻保藏温 度为-196°C。优选地，所述步骤幻中培养胚性细胞的方法包括采用液体培养基悬浮培养的步 骤；优选地，所述培养基为添加了生长抑制剂如5-120 μ mol/L脱落酸和/或渗压剂如蔗糖 的1/2 Litvay培养基；更优选地，所述的培养条件为20-30°C，黑暗，60-120转/分钟摇床培养。优选地，所述步骤幻中培养步骤2~)得到的胚性细胞的方法还包括催化体细胞 胚成熟的处理；更优选地，所述处理是采用船式RAFT培养方法来实现的，优选地，所述船 式RAFT培养的培养基为添加了生长抑制剂如5-120um/L脱落酸和/或渗压剂如蔗糖的 Litvay培养基；更优选地，所述的培养条件为20-30°C，黑暗静培养。优选地，由于裸子植物或被子植物的种子或幼苗均能诱导出胚性细胞组织，故所 述制备植物胚性细胞组织的外植体选自裸子植物或被子植物种子或幼苗；更优选地，所述 裸子植物包括松科、柏科和杉科，如冷杉属、松属、云杉属、铁杉属、假铁杉属、金钟柏属、桧 属、落叶松属、紫杉属和红杉属；所述被子植物包括油棕、刺葵属桉树、栎属、葡萄属、苹果 属、小麦属、稻属、大豆属、燕麦属、芸薹属、甘蔗属、大麦属、荞麦属、棉属、甜菜属、落花生 属、蛇麻籽属、番薯属、蕉麻芭蕉属、木薯、咖啡属、山茶属、蔷薇属、古柯属、大麻属、罂粟属、 番木瓜属、椰子属、胡萝卜属、苜蓿属、玉米属、可可属、槭属、桤木属、杨梅属、泡泡树属、桦 木属、鹅耳枥属、山核桃属、栗属、朴属、紫荆属、扁柏属、山茱萸属、柳杉属、桉树属、水青冈 属、白赌树属、阜荚属、肥阜荚属、金缕梅属、胡桃属、鹅掌楸属、木莲属、苹果属、桑属、紫树 属、铁木属、悬铃木属、杨属、李属、栎属、鼠李属、漆树属、柳属、接骨木属、檫木属、花楸属、 椴树属、榆属以及荚莲属；进一步优选地，所述制备植物胚性细胞组织的外植体为云杉属植 物种子的合子胚。另一方面，本专利技术提供了上述方法在制备蛋白质中的用途；优选地，所述蛋白质包括任何一种具有研究，工业或药用价值的蛋白质或多肽，例如疫苗或单克隆抗体等，具体包 括重组人类生长素、人类生长素受体拮抗剂(HGRA)、胰岛素、干扰素、细胞因子等。又一方面，本专利技术还提供了一种用于制备蛋白质的胚性细胞组织，所述胚性细胞 组织为针叶类植物的胚性细胞组织。优选地，所述其胚性细胞组织是通过诱导白云杉种子的合子胚而形成。本专利技术所采用的针叶类植物体细胞胚的生产是利用该过程所获得的体细胞胚制 备异类蛋白质，即用针叶植物胚性细胞和在液体培养液中进行体胚生成以获得高浓度蛋白 质的制备。本专利技术所展示的专利技术独立地或以联合的方式解决了所报道的使用生物反应器悬 浮培养液中制备重组蛋白的三种弱点，具体详述如下首先胚性细胞组织本身具备比其它非胚性细胞更强的蛋白质合成机制，转化胚性 细胞并经过对转基因的胚性细胞的挑选，获得高产率的细胞组织，可以克服现有蛋白产率 低的缺点。其次，本专利技术所提供的白云杉胚性细胞悬浮液发酵培养可被操作放大到 1500-7500升，有效解决了现有技术中使用较小规模生物反应器所带来的较高超薄的缺陷。 然后更本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种制备蛋白质的方法，其特征在于，所述方法是通过将含有需要制备的蛋白质基因转化到植物胚性细胞中进行培养来制备蛋白质的。

【技术特征摘要】
1.一种制备蛋白质的方法，其特征在于，所述方法是通过将含有需要制备的蛋白质基 因转化到植物胚性细胞中进行培养来制备蛋白质的。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤1)制备植物胚性细胞组织；2)将需要制备的蛋白质基因转入步骤1)所制备的胚性细胞组织中；3)培养步骤幻得到的胚性细胞组织，使其发育成熟为体细胞胚；4)从步骤幻得到的体细胞胚中提取蛋白质。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中制备植物胚性细胞组织 的方法包括采用半固体培养基诱导体细胞分化成胚性细胞和采用液体培养基增殖的步骤; 优选地，所述培养基为添加了 1 20 μ mol/L生长素和/或1 20 μ mol/L细胞分裂素的 l/2Litvay培养基；更优选地，所述的培养条件为20 30°C，黑暗，90-120转/分钟摇床培养。4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中将需要制备的蛋白质 基因转入胚性细胞的方法选自微粒-介导传递技术、原生质电穿孔方法、聚乙二醇析出技 术、直接基因转移技术、生物体外原生质转化技术、植物细胞原生质或胚性愈伤组织显微注 射技术和土壤农杆菌转化方法。5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤幻中培养步骤2) 得到的胚性细胞组织的方法包括采用液体培养基悬浮培养的步骤；优选地，所述培养基为 添加了生长抑制剂如5 120 μ mol/L脱落酸和/或渗压剂如蔗糖的l/2Litvay培养基；更 优选地，所述的培养条件为20 30°C，黑暗，60 120转/分钟摇床培养。6.根据权利要求2至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在超低温下 冷冻保藏所述步骤1)中制备的胚性细胞组织或步骤幻中制备的转入蛋白质基因的胚性细 胞组织的步骤；优选地，所述冷冻保藏温度为_196°C。7.根据权利要求2至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：王为民，
申请(专利权)人：王为民，吕新波，杨博文，钟云翔，
类型：发明
国别省市：84