抑制龋齿病原菌特异性抗体制剂制造技术

一种通过对健康妊娠母牛接种含变异链球菌抗原的疫苗，并从免疫接种乳牛分泌的初乳及牛奶中制备抗变异链球菌特异性抗体，制备多种形式制剂，应用于预防和治疗龋齿的方法，其特征是，通过已知的细菌疫苗技术，制备变异链球菌灭活细菌冻干粉的多价抗原性疫苗，在健康母牛分娩前、后分次肌肉注射，收集免疫乳牛分泌的初乳及牛奶，通过去脂、滤除酪蛋白、超滤浓缩等程序制备抗变异链球菌的特异性免疫球蛋白，应用于预防和治疗龋齿。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种有效抑制或减少龋齿发生的抗变异链球菌特异性抗体制剂，更具体地说，本专利技术涉及一种通过对健康妊娠母牛接种含变异链球菌抗原的疫苗，并从已免疫接种乳牛分泌的初乳及牛奶中制备抗变异链球菌的特异性抗体，制备多种形式制剂，应用于预防和治疗龋齿。专利技术技术背景现代研究证实，细菌的存在是龋齿发生的主要条件，口腔内有大量的细菌生存，其中一些细菌尤其是变异链球菌，具有产生有害牙齿的化学物质的能力，龋齿发生取决于牙龈表面上的小孔底部或正在长出的牙的吻合缝隙被某些菌群所覆盖，如果在菌群中繁殖产生变异链球菌(Streptococcus mutans，MS)，就会形成龋牙斑。变异链球菌(MS)阳性患者龋齿发生是一个多原因的过程，普遍认为主要是食物中含有的糖类物质经过咀嚼吞咽，一部分残留于口腔内，被致龋菌所利用，产生对牙齿具有腐蚀性的物质，从而破坏牙体硬组织，进而导致龋齿的发生。实验证明，应用特异性抗体对抗该类菌群(MS)，能明显抑制细菌菌群的生长，尽管变异链球菌存在于大多数人的口腔中，但是通常存在着一定的抵抗因素，限制其增长，一旦口腔中存在适合细菌繁殖的环境，该细菌菌群就会快速生长，但是一旦应用某些特异性免疫球旦白，不管是口服形式或者注射途径，均能起到明显抑制其生长的效果。Michalek等人已经证明一种由免疫初乳分离的抗变异链球菌抗体能抑制牙齿表面被变异链球菌感染，在动物实验中证实，添加上述抗变异链球菌抗体到小白鼠的生龋饮食中，可以保护牙齿不生龋齿。临床试验证实，与对照组相比较，用上述特异性抗体溶液早晚漱口一分钟，连续使用两星期，显著减少了年轻人的牙斑中变异链球菌比例，但是这份研究报告并未给出具体的实施方案，制备工艺及应用技术。中国专利技术专利(申请号96199507)公布的技术中，提及免疫接种母牛并制备抗中耳炎病原菌特异性抗体，尽管其中提到对龋齿的治疗，但是并没有包含变异链球菌抗体，也未提到对龋齿预防和治疗的具体方法。本专利技术所要解决的技术问题是，制备一种成本低廉、含特异性对抗变异链球菌抗体的制剂，用来抑制或减少龋齿的发生、发展。
技术实现思路
本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是，通过已知的细菌疫苗技术，制备变异链球菌灭活细菌冻干粉的多价抗原性疫苗，在健康母牛分娩前、后分次肌肉注射，收集免疫乳牛分泌的初乳及牛奶，通过去脂、滤除酪旦白、超滤浓缩等程序制备抗变异链球菌的特异性免疫球旦白，应用于预防和治疗龋齿。本专利技术的技术特征是，本专利技术所选用的，用来制备接种疫苗的细菌种类是变异链球菌(Streptocaccus mutans，MS)，其细菌种类包括但不限于变异链球菌AHT(S.mutans)，变异链球菌BHT(S.mutans)，变异链球菌10449(S.mutans 10449)，变异链球菌6715(S.mutans 6715)，这些变异链球菌是引起龋齿的主要细菌。上述细菌菌种可以从美国细菌培养收集中心(American Culture Collection)获得，也可以从相关已建立菌种的大学、研究所获得，所获的细菌菌种按规定方法进行培养，控制菌群的纯度，在确定所获菌种纯度后，可以接种单个菌属在500ml的标准细菌培养基内，按照规定的方法进行培养。本专利技术的技术特征是，所有变异链球菌采用静止培养方法进行培养，每个培养容器在37℃培养48小时，然后加热至56℃持续两小时，以杀死培养的细菌，用已灭活的细菌样本接种在细菌培养基上，于37℃温度下孵育24小时，检测细菌是否完全灭活，只有细菌完全被灭活并且细菌培养试验阴性时，才能进行下一步骤，消毒的培养物用蒸馏水洗五次，然后在离心机上高速离心收集培养物，离心速度为4000转/分，已经清洗、高温灭活的细菌培养物浸泡在-90℃的液氮中冷冻后，送入冷冻干燥装置制备干粉。本专利技术的技术特征是，采用不同种类变异链球菌制备的细菌干粉，被等量称重，这些不同种类的细菌干粉混合，用一定量生理盐水溶液溶解、搅拌、混匀，制备浓缩的变异链球菌抗原溶液，用生理盐水反复稀释，直至浓度达到下列标准，采用分光光度计测量，在660埃的波长下，光密度计数在0.5～0.7％光吸收读数，最终的稀释浓度在2.times.10.sup.8cells/ml，在0℃下贮存，上述配制程序应在免疫接种前完成。例如，分别制备变异链球菌AHT，BHT，10449和6715菌种的细菌干粉，每种菌种细菌干粉称重1克，共计准备细菌干粉4克，将不同菌种的干粉混合，并用500ml灭菌生理盐水混合制备悬浮液，在500ml的悬浮液中含有4克变异链球菌干粉，每毫升溶液内含有8毫克的抗原，从上述高浓度悬浮液中取出1ml样本反复稀释，直至在分光光度计660埃的波长上光密度读数为0.5～0.7％的光吸收读数上，最终浓度大约在2.times.10.sup.8 cells/ml，制备的抗原悬浮液装在多个无菌小瓶内，并在0℃低温下贮存。本专利技术的技术特征是，从浓缩液中制备最终浓度的稀释液在临近免疫接种前制备，常规的程序是应该溶解足够数量的抗原，制备多个小瓶，以接种多头母牛，为了证实抗原溶液的无菌性，在免疫接种前24小时从冷冻贮存处取出，抗原浓度用无菌生理盐水调整至最终浓度(2.times.10.sup.8cells/ml)，并分装至不同的消毒容器内，取1ml的样品在37℃温度下孵育24小时，以最终检验其灭活程度，只有完全灭活的抗原溶液才能使用，在接种后瓶中乘余的疫苗应该被丢弃。本专利技术的技术特征是，按本专利技术上述方法制备变异链球菌疫苗，免疫接种每头乳牛的剂量是5ml变异链球菌抗原溶液(在2.times.10.sup.8 cell/ml浓度下)，注射部位在臀部肌肉最丰厚处，第一次注射在预期分娩日前3～4周，以后每隔2周注射一次，在整个产奶期始终重复注射。本专利技术的技术特征是，选择变异链球菌接种的乳牛，必须是经过各种常规的兽医学检查并证明健康、无疾病的妊娠母牛，结核菌素试验和其他已知的传染病检测应该正常，任何有疾病可能性的乳牛的初乳及牛奶都不应该被用来制备本专利技术的制剂，而且，在妊娠母牛被免疫接种后，应定期检测其血清样本，直至在其血清中出现高滴度的变异链球菌抗体后，才能收集其初乳和牛奶作为制备本专利技术制剂的原料，其变异链球菌抗体滴度测定方法可以采用任何已知的测定病原菌抗体滴度的方法，例如ELISA方法等，为了更准确测定其变异链球菌抗体水平，必要时可以用未进行免疫接种孕牛的血清作为对照。本专利技术的技术特征是，从上述被免疫接种乳牛初乳和牛奶中制备特异性免疫球旦白的方法是，将初乳或牛奶用蒸馏水按1∶3的比例进行稀释，用离心方式从溶液中去除脂肪，通过酸化、加热稀释液的方式凝集和沉淀酪旦白，用离心或过滤方式移除包凝集的酪旦白，然后用超微滤膜进行浓缩，无菌过滤，冷冻干燥或喷雾干燥制成液体状制剂或干粉状制剂。另一种变通的方法也同样可以制备相似纯度的特异性抗体，即在脱脂初乳或脱脂牛初中滴入酸剂使其酸化后加热及粗过滤，以去除酪旦白，随后用氯化钠溶液稀释，收集上清液，初步过滤，然后浓缩、中和，最后进行无菌过滤或冷冻干燥或喷雾干燥得到相似纯度产品。本专利技术的技术特征是，采用本专利技术方法制备的抗变异链球菌特异性抗体，可以制备成多种形式的药物制剂、营养制剂或强化食品形式，应用于预防和治疗龋齿，这些制本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过对健康妊娠母牛接种含变异链球菌抗原的疫苗，并从免疫接种乳牛分泌的初乳及牛奶中制备抗变异链球菌特异性抗体，制备多种形式制剂，应用于预防和治疗龋齿的方法，其特征是，通过已知的细菌疫苗技术，制备变异链球菌灭活细菌冻干粉的多价抗原性疫苗，在健康母牛分娩前、后分次肌肉注射，收集免疫乳牛分泌的初乳及牛奶，通过去脂、滤除酪旦白、超滤浓缩等程序制备抗变异链球菌的特异性免疫球旦白，应用于预防和治疗龋齿。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：高春平，
申请(专利权)人：高春平，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]