靶向传输基因的载基因微泡及其制备方法和用途技术

本发明专利技术提供一种能靶向传输基因的新型基因传输载体－载基因微泡，这种载基因微泡主要由包膜构成物、含氟惰性气体内核、基因保护剂、表面活性剂、质粒构成。本发明专利技术还提供了这种载基因微泡主要采用同步声振法制备而成。本发明专利技术为基因治疗提供一种可通过静脉注入的新型高效靶向基因传输载体，不但适用于基因的传输，同样适用于药物的靶向传输。不仅能高效传输及保护基因，而且合成原料均为药理学可接受材料，安全无毒，适于在超声破裂微泡靶向传输基因系统中的应用。本发明专利技术工艺简单，设备要求低，适合推广应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种靶向基因传输载体，具体地说是一种应用于超声破裂微泡靶向传输基因系统的载基因微泡。它可应用于心血管疾病的基因治疗，也可应用于肝脏、肾脏、前列腺、乳腺、肌肉等实质脏器疾病的基因治疗。本专利技术还提供了这种载基因微泡的制备方法。
技术介绍
随着人类基因组计划的开展和分子生物学研究的逐步深入，众多疾病的分子机制的阐明和致病基因不断发现，基因治疗已经从单基因遗传性疾病的治疗发展到多基因常见多发病的治疗，尤其在心脑血管疾病及各种肿瘤的治疗中展现出良好应用前景。但成功的基因治疗需要安全高效的转基因载体和基因输送方法。尽管有多种病毒载体，如腺病毒、腺相关病毒和慢病毒等能导致外源基因高效转染与表达，然而其表现出的肝脏毒性、致炎性、免疫原性和潜在的致瘤性引起国内外学者对其安全性的深切担忧。非病毒载体所具有安全性高、容量大和易制备等优点可能较病毒载体具有更好的应用前景，但其基因转染效率尚有待提高。同时，随着基因治疗研究的逐步深入，人们认识到使目的基因靶向性和特异性的在特定组织部位表达，将其治疗作用与效应限制在特定的组织细胞中是基因治疗成功的关键。现阶段基因载体缺乏靶向性，而采用局部注射等方法将目的基因导入特定组织内，由于其基因转染效率低且可能需要外科手术暴露靶组织，可操作性较差，严重限制其广泛应用。如何开发出无创、高效、靶向基因传输系统是基因治疗研究的热点问题。近来发现超声诱导传统超声对比剂-微泡空化能增强基因转染效率达10～3000倍。且体内应用发现经静脉注入微泡后，采用超声靶向破裂微泡介导基因转染时，微泡不但作为空化核心增强基因转染效率，同时也可作为基因传输载体释放基因至特定的部位而达到靶向传输基因的目的。作为超声对比剂的微泡是一种直径类似于红细胞(3～6μm)的含气小泡组成，经静脉注入后能通过肺循环到达组织毛细血管内，在超声作用下具有线性散射、非线性散射等特性，使实质器官在超声检测时产生良好的对比显影效果。目前美国FDA已批准Albunex、Optison两种声振白蛋白微泡应用于临床，而Levovist已在欧洲批准临床应用。其中以含惰性气体的白蛋白微泡Optison显影效果最佳，由于其在体内稳定性好，经静脉注入后其不但能使心腔显影良好，还能随血流进入毛细血管达到灌注成像效果，使心肌及其它实质器官显影。以含气微泡作为对比剂的超声造影在欧美国家已广泛地应用于急慢性心肌缺血的诊断、心功能评价和各种实质肿瘤的诊断。由于国内尚无成熟产品投入市场使用，这方面的研究已明显滞后。然而超声靶向照射破裂微泡介导基因转染与传统的超声造影作用机制有所不同，它是通过超声照射诱导靶器官内微泡空化破裂，由此产生的微波自由基等可明显增强毛细血管、细胞膜对基因及药物等大分子物质的通透性，达到增强局部基因转染的效应。但研究发现超声靶向破裂微泡介导基因转染要求微泡与基因具有时间与空间上的协同性，如果基因与微泡处于分离状态，则不但无法保证基因的靶向传输，同时基因转染效率的增强也是有限的。因而很有必要将基因整合至微泡包膜上或微泡内，把传统的超声对比剂—微泡改造成专门化基因传输载体—载基因微泡。这是超声破裂微泡靶向基因传输系统的关键之所在。目前国内外尚无作为专门化基因传输载体的载基因微泡。现阶段多利用微泡包膜白蛋白的粘附性或脂质微泡表面电荷特性，简单地将基因粘附于传统超声对比剂-微泡表面而制备基因黏附微泡，其不但携带基因量有限，而且变异性大，可重复性及稳定性差，严重影响基因转染效率。更为重要的是由于基因裸露在微泡表面，其在体内应用时不能防止体液对基因的稀释及循环中DNase对基因的降解，无法保证将大量的基因输送至靶组织。因而如何在保证基因性能不受影响的前提下，通过简单有效的工艺将基因整合至微泡包膜内增加其基因携带量及稳定性，制备基因携带量大、性能稳定的载基因微泡作为新的基因传输载体是一个有待解决的关键问题。无疑它的研制成功将具有良好的应用前景和巨大的经济效益。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种能靶向传输基因的新型基因传输载体—载基因微泡，这种载基因微泡主要由包膜构成物、含氟惰性气体内核、基因保护剂、表面活性剂、质粒构成。本专利技术的载基因微泡最重要特征在于，将基因稳定整合在微泡包膜内，这种新型载基因微泡不但性质稳定，能提高基因转染时能达到基因-微泡时间与空间上的协同性；而且由于基因包埋在微泡包膜内，在体内使用时能防止血液对基因冲刷和稀释，还能保护基因免受循环中DNase的降解，保证将大量基因输送至靶组织；同时这种新型载基因微泡携带基因容量明显明显优于基因粘附微泡，且在一定范围内随基因投入量增加而呈线性增加。(参见图1)其有效携基因量为110～166.7μg/ml，包封率为25.1±4.6％。本专利技术的载基因微泡直径分布范围为2.6～8.3μm，其中98％以上微泡直径小于6μm，本专利技术通过增加表面活性剂后载基因微泡均匀性明显增加，90％以上载基因微泡直径分布在3～5μm，这种直径分布范围是靶向传输基因的先决条件，它能保证载基因微泡通过肺循环而将基因输送至靶器官微循环内。与传统的超声成像不同，超声靶向照射破裂微泡介导基因转染的机制是在定向超声照射作用下，靶器官内微泡空化破裂将基因释放于靶器官内达到靶向传输基因的目的，同时微泡破裂所产生的微波及自由基等可明显增强基因转染效率。而微泡空化产生微波能量及自由基多少与微泡直径成正相关，因而在保证微泡能通过肺循环进入毛细血管的同时微泡直径应较为均匀，过小微泡影响基因转染效率。本专利技术的载基因微泡浓度大于5×108/ml。载基因微泡作为基因传输载体，这种浓度可保证微泡能将大量基因输送靶组织。其有效浓度范围为1×108/ml～1×1010/ml，优选浓度范围为5×108/ml～9×108/ml。本专利技术通过将微泡浓缩可将微泡浓度进一步增加至1.6×109/ml。其完全达到体应用的血液流变学与声学要求。本专利技术的载基因微泡稳定性较好，在室温开放条件下其半衰期为18.6～25.7小时。经优选法制备的载基因微泡的半衰期为34.1～35.7小时。这种良好的稳定性可防止体内应用时大量载基因微泡在非靶器官处出现塌陷破裂，保证将载基因微泡仅在靶组织处破裂而释放基因。本专利技术的另一目的是提供这种载基因微泡的制备方法，采用同步声振法制备而成，主要通过以下步骤实现(1)将基因保护剂与含目的基因的质粒按重量比为1/10～3/1混合，(2)将包膜构成物与表面活性剂混合，(3)将步骤(1)的混合物加入步骤(2)的混合溶液中，(4)将一定量的含氟惰性气体注入步骤(3)的混合溶液中，(5)将步骤(4)的含气混合液体手摇振动30～40秒，将超声发生仪探头置于混合溶液中进行持续性低频高能超声声振，进行超声声振处理10～15秒，超声声振期间将溶液温度控制在50～55℃。步骤(1)中所说的基因保护剂是一种多聚复合物，主要包括多聚门冬氨酸(Polyaspartic acid)、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone，PVP)、多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine，PLL)、聚乙烯乙二醇(Polyehylene glycol，PEG)、多聚环氧丙烷(Polypropylene oxide)、多聚乙烯亚胺(Polyethyleneim本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种载基因微泡，其特征是：该载基因微泡主要由包膜构成物、含氟惰性气体内核、基因保护剂、表面活性剂、含目的基因的质粒构成。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡申江，汪国忠，
申请(专利权)人：浙江大学医学院附属第一医院，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]