II型猪圆环病毒核酸疫苗的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种Ⅱ型猪圆环病毒核酸疫苗的制备方法及其应用。制备方法为：１）设计特异性引物，以ＰＣＶ２杭州株（ＨＺ０２０１）的基因组为模板，通过ＰＣＲ的方法克隆ＰＣＶ－２的ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３和ＯＲＦ４基因，与ｐＣＩ－ｎｅｏ构建为真核表达载体；２）分离猪外周血单个核细胞，通过ＲＴ－ＰＣＲ方法克隆猪ＩＦＮ、ＩＬ－２和ＩＬ－４基因，并与ｐＣＩ－ｎｅｏ构建为真核表达载体；３）以上述重组载体为基础，分别构建ＰＣＶ２　　ＯＲＦ２与ＰＣＶ２的其它基因或与猪细胞因子基因的融合表达载体；本发明专利技术的优点：（１）不需培养病毒，生产周期短；（２）不需细胞培养，有效防止其它猪源病毒的污染；（３）不表达对机体有害的致病蛋白，安全性高；（４）可同时激活体液免疫与细胞免疫应答。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物新
，尤其涉及一种II型猪圆环病毒核酸疫苗的制备方法及其应用。
技术介绍
断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)是1997年在加拿大首先发生一种新的猪病，表现进行性消瘦、呼吸困难、皮肤苍白、腹泻、黄疸。1998年，Ellis等首次分离到该病的病原，为II型猪圆环病毒(PCV2)。郎洪武等(2000)对北京、河北、山东、天津、江西、吉林、河南7省(市)22个猪群的559份血清检测表明，PCV2总阳性率为42.9％。周继勇等对浙江省杭州地区28个猪场采集了1677份猪血清，用IFA试验检测血清中PCV2抗体，结果PCV2抗体总阳性率为57.25％，表明PCV2在我国的流行情况也比较严重。PMWS对养猪业造成重大经济损失，PCV2是疫苗的研制成为急需解决的问题。常规疫苗包括灭活苗或弱毒苗，但由于PCV2在细胞培养中不产生细胞病变，难以产生高滴度的病毒粒子，用常规技术制备PCV2疫苗十分不便，至今尚无II型猪圆环病毒常规疫苗可用。核酸免疫是一种新型的免疫技术，它是将编码抗原基因的表达性载体通过肌肉注射的方法给予动物，诱导机体产生免疫应答。细胞因子佐剂对核酸疫苗的增强作用越来越受到人们的重视，根据产生的Th细胞亚群的不同，细胞因子可分为Th1型细胞因子(IL-2，IFN-γ，IL-12，IL-15，IL-18)和Th2型细胞因子(IL-4，IL-5，IL-6，IL-10)两类。细胞因子基因佐剂的应用对核酸免疫技术起了巨大的推动作用，能有效克服某些核酸疫苗免疫效力不足问题。IL-2和IFN-γ是常见的Th1型细胞因子，IL-4是常见的Th2型细胞因子，可以作为基因佐剂来增强PCV2核酸疫苗的免疫效力。我们用真核表达载体pCI-neo构建的PCV2基因、猪细胞因子、以及融合表达载体，转染PK-15细胞后，经间接免疫荧光(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)或Westernblot检测，证明能在PK-15细胞中表达。在此基础上，将其作为核酸疫苗分别免疫4-6周龄猪，发现能诱导产生针对PCV2的体液免疫和细胞免疫反应。表明我们构建的真核表达质粒可作为核酸疫苗来使用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种II型猪圆环病毒核酸疫苗的制备方法及其应用。制备方法为1)设计特异性引物，以PCV2杭州株(HZ0201)的基因组为模板，通过PCR的方法克隆PCV-2的ORF1、ORF2、ORF3和ORF4基因，与pCI-neo构建为真核表达载体；2)分离猪外周血单个核细胞，通过RT-PCR方法克隆猪IFN、IL-2和IL-4基因，并与pCI-neo构建为真核表达载体；3)以上述重组载体为基础，分别构建PCV2 ORF2与PCV2的其它基因或与猪细胞因子基因的融合表达载体；所构建的核酸疫苗免疫小鼠后，能诱导机体产生针对PCV2的体液免疫及细胞免疫反应。所构建的核酸疫苗免疫仔猪后，能诱导机体产生针对PCV2的体液免疫及细胞免疫反应。本专利技术的优点(1)不需培养病毒，生产周期短；(2)不需细胞培养，有效防止其它猪源病毒的污染；(3)不表达对机体有害的致病蛋白，安全性高；(4)可同时激活体液免疫与细胞免疫应答；附图说明图1，真核表达载体pCI-neo的结构示意图；图2，pCI-PCV2-ORF1重组质粒的鉴定，1.MluI和SalI双酶切，切出约945bp大小片段；2.以F1P1/F1P2作为引物的PCR产物960bp；3.以PC1/PC2作为引物的PCR产物1045bp；M.DNA marker；图3，猪IFN-γ、IL2、IL4基因的RT-PCR结果，分别扩增出大小为501bp、465bp、402bp的特异性条带；M.DNA marker；图4，pCI-pIL2重组质粒的鉴定，1.MluI和SalI双酶切约465bp；2，3.以PIL21/PIL22为引物的PCR产物约480bp；4.以PC1/PC2为引物的PCR产物约587bp；M.DNA marker；图5，pCI-pIL4重组质粒的鉴定，1.MluI和SalI双酶切约412bp片段；2.以PIL41/PIL42为引物的PCR产物约420bp；3.以PC1/PC2为引物进行的PCR产物约524bp；M.DNA marker；图6，pCI-pIFN重组质粒的鉴定，1.MluI和SalI双酶切约507bp；2.以IF1/IF2为引物的PCR产物519bp；3以PC1/PC2为引物的PCR产物约597bp；M.DNAmarker；图7，pCI-PCV2-ORF1转染细胞的IFA检测(200×)，以猪PCV2多抗血清为一抗、FITC标记的羊抗鼠IgG为二抗，IFA法检测转染48h后的PK15，发现细胞的胞浆中呈现特异性的荧光染色；图8.pCI-PCV2-ORF2转染细胞的IFA检测(200×)，以猪PCV2多抗血清为一抗、FITC标记的羊抗鼠IgG为二抗，IFA法检测转染48h后的PK15，发现细胞的胞浆中呈现特异性的荧光染色。具体实施例方式本专利技术所说PCV2 ORF2与PCV2其它基因的融合表达载体的构建是将PCV2ORF2与PCV2 ORF1、ORF3、ORF4基因相连接，并亚克隆于真核表达载体pCI-neo，构建重组质粒pCI-PCV2-ORF2-ORF1、pCI-PCV2-ORF2-ORF3、pCI-PCV2-ORF2-ORF4作为PCV2核酸疫苗。PCV2 ORF2与猪细胞因子基因的融合表达载体构建是将PCV2 ORF2与猪IFN-γ、IL-2、IL-4基因相连接，并亚克隆于真核表达载体pCI-neo，构建重组质粒pCI-PCV2-ORF2-pIFN、pCI-PCV2-ORF2-pIL2、pCI-PCV2-ORF2-pIL4作为PCV2核酸疫苗。本专利技术性能的测定1)将纯化的重组质粒，用脂质体转染PK15细胞，转染后收集培养不同时间(24h、48h、72h)的细胞上清液进行ELISA检测或活性试验，对培养48h后的细胞进行IFA或Western blot检测，证明重组载体在真核细胞中的可以正确表达。2)用制备重组载体免疫6-8周龄BALB/C雄鼠，间隔2周免疫三次，证明重组质粒可诱导机体产生针对PCV2的体液免疫及细胞免疫反应。3)用制备的重组载体免疫4-6周龄仔猪，间隔2周免疫3次，证明重组质粒可诱导机体产生针对PCV2的体液免疫及细胞免疫反应，同时对猪无致病性。实施例1II型猪圆环病毒核酸ORF1~ORF4真核表达载体的构建根据PCV2毒株HZ0201的基因序列，分别设计PCV2 ORF1、ORF2、ORF3、ORF4基因的特异性引物，引物序列如下PCV2 ORF1基因引物f1p1ATAACGCGTCATGCCCAGCAAGAAGf1p2GCGGTCGACGACTCAGTAATTTATTTCATATGGPCV2 ORF2基因引物 f2ms1GCGGTCGACTCATTAAGGGTTAAGTGGGf2ms2TATACGCGTTTATGACGTATCCAAGGAGGPCV2 ORF3基因引物f3P1TAAGTCGACCTTACTGATGGAGTGTGGf3P2ATAACGCGTATGGTAACCATCCCACPCV2 ORF4基因引物f4P1TA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪Ⅱ型圆环病毒核酸疫苗的制备方法，其特征在于方法的步骤为：１）设计特异性引物，以ＰＣＶ２杭州株（ＨＺ０２０１）的基因组为模板，通过ＰＣＲ的方法克隆ＰＣＶ－２的ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３和ＯＲＦ４基因，与ｐＣＩ－ｎｅｏ构建为真核 表达载体，以ＰＣＶ２ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４基因作为ＰＣＶ２核酸疫苗的基本组成部分；２）分离猪外周血单个核细胞，通过ＲＴ－ＰＣＲ方法克隆猪ＩＦＮ、ＩＬ－２和ＩＬ－４基因，并与ｐＣＩ－ｎｅｏ构建为真核表达载体，以猪Ｉ ＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－４基因作为基因佐剂；３）以上述重组载体为基础，分别构建ＰＣＶ２ＯＲＦ２与ＰＣＶ２的其它基因或与猪细胞因子基因的融合表达载体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周继勇，申会刚，郭军庆，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]