白蛋白溶液及其制备方法技术

本发明专利技术涉及可用于治疗的病毒灭活的白蛋白以及生产可用于治疗的病毒灭活的白蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：（ａ）根据使所述白蛋白水溶液在低于４５℃的温度下与ＳＤ试剂接触的ＳＤ方法对第一白蛋白水溶液进行病毒灭活处理；（ｂ）利用油提取和随后的疏水作用层析，至少基本上将所述ＳＤ试剂除去，将疏水性基质、尤其是可以结合任选的疏水性基团的基质用于所述层析方法，前提是所述基团为Ｃ＞２４的脂肪族基团，以得到第二白蛋白溶液；（ｃ）任选向第二白蛋白溶液中加入选自糖、氨基酸和糖醇的一种或多种稳定剂，前提条件是不将吲哚稳定剂和Ｃ↓［６］－Ｃ↓［１０］脂肪酸用作稳定剂；随之（ｄ）将任选加入稳定剂的所述第二白蛋白溶液进行最后的加工并过滤除菌，并且任选地将其装入最终容器中。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及可用于治疗的病毒灭活的白蛋白及其制备方法。
技术介绍
白蛋白是血浆中比例最高的血浆蛋白。白蛋白可以将许多内源和外源物质结合到其分子上。这种结合能力也是其主要功能之一转运与白蛋白结合的物质的基础。由于这种结合能力，白蛋白也是许多种类化合物的主要储存库，所述化合物如长链脂肪酸、胆红素、色氨酸、甲状腺素或金属离子。药物使用的活性物质，如华法令、洋地黄毒苷或萘普生也可以与白蛋白结合而被转运。然而，就此而论，关键在于知道只有各药物活性物质的游离部分，即未与白蛋白结合的部分表现出药理作用。减少与白蛋白结合的部分就增加了游离部分，因而也增加了药理活性。所有可商业购得的白蛋白制剂是通过改进的Cohn分级法制备的，该方法通常由几个分级步骤所组成。白蛋白浓缩物的巴氏灭菌(60℃下10小时)作为病毒灭活步骤已被应用了几十年。为了避免此步骤期间白蛋白的变性，使用了稳定剂。根据欧洲药典，使用辛酸钠或N-乙酰基色氨酸或二者的组合作为稳定剂。为了获得病毒灭活的因子VIII制剂或其它血浆蛋白，采用例如EP-A-0 131 740所述的所谓SD方法。该公开(laid-open)说明书通过引用并入本文。根据他们自己的研究，申请人认识到可商业购得的白蛋白的结合能力明显低于天然白蛋白。这被解释为用于巴氏灭菌法的稳定剂被白蛋白所结合，因而占据了重要的转运位点，由此结合能力下降。这意味着当施用药物活性物质时，获取该白蛋白制剂的患者暴露于浓度明显上升的游离活性物质，即未与白蛋白结合的物质，这自然意味着对于患者的过量药理作用和副作用风险增加。本专利技术的目的在于提供没有该缺点的白蛋白制剂。附图说明图1示出层析分离过程中不同来源的白蛋白的紫外吸收行为与洗脱时间的函数关系。图2示出在不同浓度的苯基丁氮酮存在下不同来源的白蛋白的结合行为。图3示出在不同浓度的华法令存在下不同来源的白蛋白的结合行为。该目的通过可用于治疗的病毒灭活的白蛋白来实现，所述白蛋白具有与巴氏灭菌法病毒灭活的白蛋白相比更高的物质结合能力。具体而言，根据本专利技术的白蛋白具有的结合能力与巴氏灭菌法病毒灭活的白蛋白相比提高至少10％，通常提高20-500％，尤其是提高100-500％。在个别情况下，甚至可以得到更高的值，这取决于所结合的物质。所述物质主要是由天然白蛋白所结合和转运的物质，具体包括低分子量的活性物质。具体而言，所述低分子量活性物质是分子量通常≤10000Da的有机或无机物质、核酸、多肽。对于上述药物用途来说，根据本专利技术的白蛋白可以是液体溶液形式或固体状态，尤其是冻干形式。根据本专利技术的白蛋白也可以通过特征为以下步骤的组合的方法来获得(a)在低于45℃的温度下，利用与SD试剂接触的SD方法，对第一白蛋白水溶液进行病毒灭活处理；(b)通过油提取和随后的疏水作用层析至少基本除去SD试剂，其中将疏水性基质，尤其是可任选结合疏水性基团的基质用于所述层析，前提条件是所述基团为多于24个碳原子的脂肪族基团，以得到第二白蛋白溶液；(c)任选向第二白蛋白溶液中加入选自糖、氨基酸和糖醇的一种或多种稳定剂，前提条件是不将吲哚稳定剂和C6-C10脂肪酸用作所述稳定剂；随之(d)将任选加入稳定剂的所述第二白蛋白溶液进行最终包装和除菌过滤，并且任选将其装入最终容器中。术语“吲哚稳定剂”应该包括所有具有吲哚骨架的稳定剂，如N-乙酰基色氨酸。已由EP-A-0 131 740得知病毒灭活的SD(＝溶剂/表面活性剂(solvent/detergent))方法。其说明书除了其它蛋白质之外也提及了白蛋白。事实上，从EP-A-0 366 946得知SD试剂可用植物油，例如大豆油除去，随后进行疏水作用层析。因而，由于与根据EP-A-0 366 946的方法部分一致，因此认为根据权利要求8的方法在一个方面类似于根据该专利技术的白蛋白制备方法。然而，对于层析而言，上述专利优选建议一种基质，例如结合疏水性侧链，即支化或非支化的C6-C24烷基链的二氧化硅基质。令人惊奇的是，已经发现使用疏水性基质代替具有例如C18烷基链作为疏水性侧链的基质，得到更高的吸附洗涤剂的结合能力。因此，无需将其它疏水性基团结合到根据本专利技术采用的基质上。因此，本专利技术也涉及使用该基质的方法。有利的是，病毒灭活在25-40℃的温度范围内完成。在根据本专利技术的方法的优选实施方案中，病毒灭活在4-6小时的时间内完成。甘氨酸非常适合作为稳定剂。蓖麻油非常适合用于油提取法。已经发现如果将聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物或甲基丙烯酸酯基聚合物用作所述疏水性基质，则特别有利于纯化效果。根据本专利技术使用的疏水性基质可以具有多于24个碳原子的支化或线性脂肪族基团。根据所采用的起始材料不同，可能需要脱除所谓的前激肽释放酶活化因子(PKA)活性的步骤。已知PKA通过从高分子量激肽原(HMWK)释放血管活性物质血管舒缓激肽，导致在施用含PKA的制剂之后血压下降。PKA通常在蛋白质制剂的巴氏灭菌期间失活。由于上述原因，根据先前的经验而知至少使PKA部分失活的热处理不利于根据本专利技术制备的白蛋白，因此如果需要可以通过特殊手段除去PKA。这包括与活性炭孵育，之后过滤，优选使用深度过滤器，或者通过含活性炭的过滤器直接过滤。此外，离子交换剂，如阳离子或阴离子交换剂非常适合用来除去PKA。这可以通过使含白蛋白的溶液接触柱内基质，或通过技术人员所公知的间歇方法来实现。作为选择，硫酸葡聚糖或肝素基质可用来减少PKA。在所得的含白蛋白溶液中，PKA得以减少，并且在最优情况下不再能被检测到。根据现有技术，PKA等同于产生自其酶原形式(FXII)的活化(凝血)因子XII(FXIIa)。这可以通过自催化或酶催化作用，例如激肽释放酶作用在表面发生。因此，同样可推荐脱除作为PKA前体的FXII(酶原)，但并非必需。然而，为了防止PKA从酶原形式的重新产生，也可以将酶原通过离子交换层析除去。可任选进行FXII的脱除以便能够长期保存液态白蛋白。将已经以冰冻状态储存的白蛋白溶液解冻之后，这也很重要。因此，在将白蛋白溶液装入最终容器之后可将其深度冷冻，但也可以将其冷却至液态或冻干状态并在至多40℃的温度下贮存。因而，为了去除PKA或PKA前体物质，可以通过本身已知的方式除去存在于步骤(a)、(b)或(c)之前或之后的任何前激肽释放酶活化因子(PKA)的活性，其中具体是使白蛋白溶液A)与活性炭接触，随后从白蛋白溶液中除去活性炭；或B)进行离子交换层。步骤(A)在白蛋白浓度为1-25重量％，尤其是5-10重量％下完成。步骤(B)具体而言在白蛋白浓度为5-10重量％下进行。在根据本专利技术的方法的另一实施方案中，离子交换剂是阴离子交换剂，并将白蛋白溶液用100-150mmol/l的乙酸钠缓冲，pH在5.0-6.0范围内，尤其是＜5.5。此外，所述方法的特征在于所述离子交换剂是阳离子交换剂，并且将白蛋白溶液用20-30mmol/l的乙酸钠缓冲，pH在4.8-6.0的范围内，尤其是在4.8-5.2的范围内。本专利技术还涉及可通过根据本专利技术的方法得到的白蛋白溶液。该方法可用于得自不同来源的白蛋白溶液，例如得自血浆或血清，得自分级血浆的含白蛋白级分，得自重组子制备之后从培养物上清液回收的白蛋白，或得自转基因制备的白蛋白，或得自含白蛋白的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可用于治疗的病毒灭活的白蛋白，所述白蛋白的物质结合能力与通过巴氏灭菌法病毒灭活的白蛋白相比得以提高。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】AT 2003-2-13 A 218/20031.一种可用于治疗的病毒灭活的白蛋白，所述白蛋白的物质结合能力与通过巴氏灭菌法病毒灭活的白蛋白相比得以提高。2.根据权利要求1的白蛋白，其中所述结合能力与巴氏灭菌法病毒灭活的白蛋白相比提高至少10％。3.根据权利要求1和/或2的白蛋白，其中所述结合能力与巴氏灭菌法病毒灭活的白蛋白相比提高至少20％-500％。4.根据权利要求1-3中至少一项的白蛋白，其中所述物质是低分子量的活性物质。5.根据权利要求1-4中至少一项的白蛋白，其中所述低分子量的活性物质是分子量至多为10000Da的有机物质、核酸、多肽。6.根据权利要求1-5中至少一项的白蛋白，为液体溶液或固态形式。7.根据权利要求6的白蛋白，为冻干形式。8.一种制备白蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤(a)通过在低于45℃的温度下，利用与SD试剂接触的SD方法，对第一白蛋白水溶液进行病毒灭活处理；(b)通过油提取和随后的疏水作用层析来至少基本除去SD试剂，其中将疏水性基质，尤其是可任选结合疏水性基团的基质用于所述层析，前提条件是所述基团为多于24个碳原子的脂肪族基团，以得到第二白蛋白溶液；(c)任选在第二白蛋白溶液中加入选自糖、氨基酸和糖醇的一种或多种稳定剂，前提条件是不将吲哚稳定剂和C6-C10脂肪酸用作所述稳定剂；随之(d)将任选加入稳定剂的所述第二白蛋白溶液进行最终包装和除菌过滤，并且任选将其装入最终容器中。9.根据权利要求8的方法，其特征在于所述病毒灭活在25-40℃的温度下进行。10.根据权利要求8和/或9的方法，其特征在于所述病毒灭活在4-6小时的时间内完成。11.根据权利要求8-10中任一项的方法，其特征在于将甘氨酸、谷氨酸、精氨酸或赖氨酸或其组合用作所述稳定剂。12.根据权利要求8-10中任...

【专利技术属性】
技术研发人员：维尔纳格林格，卡塔琳娜波克，于尔根勒米施，托尔艾纳斯韦，克里斯托夫坎尼希特，
申请(专利权)人：奥克塔法马股份有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]