本发明专利技术属于生物医药技术领域，具体属于蛋白质药物技术领域。本发明专利技术要解决的技术问题是现有的ＡＴＷＬＰＰＲ肽在体内半衰期短，用量大。解决该问题的技术方案是提供一种白蛋白变异体。该白蛋白变异体将白蛋白Ｃ末端的ＫＥＱＬＫ肽段突变为ＷＬＰＰＲ肽段后得到的变异体。该人白蛋白变异体完全保留有人白蛋白的功能，同时具有了新的ＡＴＷＬＰＰＲ序列功能。体外实验证明，该白蛋白变异体在体外可明显抑制ＶＥＧＦ诱导的血管内皮细胞增殖和移动，其效率同小肽相当。然而注射到动物体内其抑制家兔角膜血管生成作用的效率与相同浓度的小肽相比，前者是后者的４０－６０倍。该人白蛋白变异体可作为一种高效新型的抗血管生成药物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种蛋白变异体及其制备方法。
技术介绍
“血管生成” (angiogenesis) —词于1787年由英国外科医生John Hunter首次提 出。由此，人们发现“血管生成”与胚胎发育、组织再生以及慢性炎症有关[1]。直到1971年 Folkmani证明“血管生成”与肿瘤生长有关[2]。从此，“抗血管生成”(anti-angiogenesis) 成为一种新的抗肿瘤治疗战略。血管内皮细胞的生长和分化调控是血管生成的关键步骤。已证明前者受酪氨酸蛋 白激酶调节。血管内皮细胞生长因子(VEGF)受体-2(KDR)与VEGF结合，导致其受体酪氨 酸蛋白激酶活性被活化，从而启动一系列后续细胞信号传导通路。这一过程对于调控内皮 细胞前体分化以及原始血管网络的形成至关重要。因此，抑制KDR的活性是抑制血管生成 的关键点之一。[3]临床实验中，许多小分子化学物质可特异性抑制KDR酪氨酸蛋白激酶活性，从而 有显著的抗血管生成效应。然而，临床实验结果证明这些小分子化学物质毒性副作用较大。 最近，有人用中和抗体技术阻断KDR的生物学活性，实验证明这些抗体有有效的抗血管生 成作用。进一步这些抗体已成功用于临床肿瘤抗血管生成治疗[4]。由于噬菌体显示技术(phage-display technology)的广泛应用，人们筛选到许多 具有生物学活性的多肽[5]，其中一些具有十分有效的药物学效应。然而，由于小肽分子在 体内应用的局限性，到目前为止很少有小肽药物的成功上市。但具有药物效应小肽分子的 发现，也为进一步药物的设计和改造提供了非常有用的基本信息。现已发现ATWLPra肽可 以抵抗VEGF在体外刺激血管内皮细胞的增殖，并且可在动物体内完全阻断VEGF诱导的血 管生成[6]。然而，这一小分子肽在体内半衰期短，用于治疗肿瘤效果有限。人白蛋白(人血清白蛋白)是血液中最丰富的蛋白质之一，大约浓度为50mg/ ml (600PM)，其半衰期约为19天[11，12]。白蛋白对于维持血液的PH，胶体渗透压有着非 常重要的作用，同时它也作为体内许多代谢物和脂肪酸的载体。许多药物进入体内也利用 白蛋白作为运送载体。最近，有人成功地利用白蛋白结合多肽将小肽药物附着在白蛋白分 子上，从而大大提高了小肽药物在体内的半衰期和药物疗效作用[13]。也有人将多肽药物 分子直接与白蛋白一起表达成融合蛋白，从而利用白蛋白在体内的特性提高其多肽药物在 体内的半衰期以及生物学疗效[14]。但是，直接将白蛋白进行定向化改造使之具有其他的 活性还未见报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的是现有的ATWLPra肽体内半衰期短，用量大的问题。解决该问题的技术方案是提供一种白蛋白变异体。该白蛋白变异体为白蛋白C末 端的KEQLK肽段突变为WLPra肽段而得。其中，所述的白蛋白为人白蛋白。进一步的，上述白蛋白变异体的氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。本专利技术还提供了编码上述的白蛋白变异体的基因。进一步的，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。同时，本专利技术提供了含有上述基因的表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞。为了制备上述的白蛋白变异体，本专利技术还提供了一种制备所述白蛋白变异体的方 法。该方法包括以下步骤a、将白蛋白编码基因序列中编码肽段KEQLK序列的核苷酸序列诱变成编码氨基 酸肽段WLPra序列的核苷酸序列，得到白蛋白变异体编码基因序列；b、将白蛋白变异体编码基因序列到连接到表达载体中；C、将表达载体转入宿主中进行表达得到白蛋白变异体。其中，上述的表达载体优选为真核表达载体，宿主细胞优选为真核宿主细胞。其中，上述的将白蛋白编码基因序列中编码肽段KEQLK序列的核苷酸序列诱变成 编码氨基酸肽段WLPra序列的核苷酸序列的诱变方式可以使用定点诱变引物进行PCR完成 定点诱变。本专利技术要解决的另一个技术问题是提供上述的白蛋白变异体或表达载体在制备 抗血管生成药物中的用途。同时本专利技术提供了一种抗血管生成药物，该抗血管生成药物由 上述的白蛋白变异体或表达载体添加药学上可接受的辅助性成分制备而成。具体说来，本专利技术直接将人白蛋白分子进行突变改造，从而附与产生的白蛋白变 异体具有新的生物学功能。这不同于通过白蛋白结合分子将外源药物分子与白蛋白结合从 而形成一个“白蛋白药物”复合物；或药物分子与白蛋白融合在一起形成一种化学融合蛋白 的现有途径。本专利技术主要通过改变白蛋白本身的分子结构，在白蛋白分子中通过氨基酸残 基置换突变，从而产生一种新自然界不存在的白蛋白分子。即将白蛋白C末端的氨基酸残 基KEQLK(人白蛋白在第565位至569位)采用分子突变方法变成WLPPR，从而在白蛋白分 子中产生了一个新的ATWLPPR功能结构(人白蛋白C末端的KEQLK残基的两端分别相邻的 残基分别为T和A)。该白蛋白分子保留有白蛋白分子的基本生物学活性，同时也具有突变 引入的新的功能结构所带来的新活性。本专利技术的有益效果在于创造性地将人白蛋白进行定位突变，从而在其分子中产 生出一段ATWLPra序列。这一白蛋白变异体具有ATWLPra多肽的功能，并且保留了白蛋白的 分子结构。这导致本专利技术白蛋白变异体在体内有与野生型白蛋白一样较长半衰期，同时可 大剂量在体内应用。这有利于提高ATWLPra的功能作用。实验结果证明本专利技术ATWLPPR-白 蛋白变异体具有与ATWLPra在体外相同的抑制血管内皮细胞的增殖作用，且前者具有显著 更强的体内抗血管生成作用。这一 ATWLPPR-白蛋白变异体为抗血管生成药物的制备提供 了一种新的有效选择附图说明图1为PHIL-D2质粒的结构简2为人白蛋白变异体分离纯化电泳图谱。Lane 1 :DEAE离子交换层析纯化样品； Lane2 抗白蛋白抗体亲和层析纯化样品图3为ATWLPI3R肽及白蛋白变异体对VEGF与Huvec细胞结合的抑制作用。VEGF 可与Huvec细胞表面VEGF受体结合。结合在细胞表面的VEGF可用细胞放射结合测定方法 (见材料和方法)用特异性125I-标记的VEGF抗体检测之。其抗体结合的量(O.D.)可直接 反映出VEGF结合在细胞表面的量。将ATWLPra肽和白蛋白变异体与Huvec细胞温育，可明 显抑制后续的VEGF与Huvec细胞的结合作用。图4为ATWLPI3R肽及白蛋白变异体对VEGF诱导Huvec细胞增殖效应的抑制作用 结果。VEGF在体外明显诱导Huvec细胞进行细胞增殖作用。其细胞增殖作用可用掺入的 3H TdR量计量之。ATWLPI3R肽和白蛋白变异体可明显抑制VEGF诱导Huvec细胞中3H_TdR 的掺入量。图5为用western-blot结果表明ATWLPPR-白蛋白变异体对VEGF细胞信 号传导的抑制作用。其中+表示这一道用了这种处理，-表示这一道没有用这种处 理，1道为ATWLPra多肽预先处理Huvec细胞，然后用VEGF刺激后的样品；2道为 ATffLPPR-HAS(ATWLPPR-白蛋白变异体)预先处理Huvec细胞，然后用VEGF刺激后的样品； 3道为ATWLPPR-HAS (ATWLPPR-白蛋白变异体)预先处理Huvec细胞，然后用VEGF刺激的样 品；4道为没有本文档来自技高网...
【技术保护点】
白蛋白变异体，其特征在于由白蛋白Ｃ末端的ＫＥＱＬＫ肽段突变为ＷＬＰＰＲ肽段而成。
【技术特征摘要】
白蛋白变异体，其特征在于由白蛋白C末端的KEQLK肽段突变为WLPPR肽段而成。2.根据权利要求1所述的白蛋白变异体，其特征在于所述的白蛋白为人白蛋白。3.根据权利要求1所述的白蛋白变异体，其特征在于其氨基酸序列如SEQID NO. 4所 示。4.编码权利要求1 3任一项所述的白蛋白变异体的基因。5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQIDN0.3所示。6.含有权利要求4或5所述基因的表达载体。7.含有权利要求6所述表达载体的宿主细胞。8.制备权利要求1 3任一项所述的白蛋白变异...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴炯，白敏，易兴旺，
申请(专利权)人：成都正能生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]
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