用细胞系生产猪瘟活疫苗的方法技术

本发明专利技术公开了一种用细胞系生产猪瘟活疫苗的方法。本发明专利技术包括如下技术步骤：（１）选择细胞系作为制苗用细胞；（２）制苗用细胞的传代与培养；（３）细胞毒种的繁殖；（４）制苗毒液的繁殖；（５）配苗、分装及冻干。本发明专利技术具有生产工艺简单且稳定、易操作，病毒含量高，批间差异小，质量易控，可显著提高疫苗产量和质量。利用本发明专利技术生产的猪瘟活疫苗安全性好、免疫效力高，对猪瘟强毒攻击具有完全的免疫保护作用。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于兽用生物制品
，更具体是涉及一种用细胞系 生产猪瘟活疫苗的方法。
技术介绍
我国目前生产猪瘟兔化弱毒疫苗所用的细胞为牛睾丸原代细胞。由于我国牛群BVD/MDV病比较普遍，用牛睾丸原代细胞制苗，易造成 细胞外源病毒污染，且产毒滴度不高，批间差异大，给疫苗产量、效 力的提高带来困难。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术存在的不足之处，提供一种用细 胞系生产猪痘活疫苗的方法。该方法具有生产工艺简单且稳定、易操 作，病毒含量高，批间差异小，质量易控，可显著提高疫苗产量和质 量。利用本专利技术生产的猪瘟活疫苗安全性好、免疫效力高，对猪瘟强 毒攻击具有完全的免疫保护作用。为达到上述目的，本专利技术采取了如下的技术方案1.用细胞系生产猪瘟活疫苗的方法，包括如下技术步骤(1) 选择细胞系作为制苗用细胞(2) 制苗用细胞的传代与培养上述细胞系经EDTA-胰酶细胞 *液消化传代，以细胞生长液继续培养，形成良好单层时，用于继 续传代或接种病毒；(3) 细胞毒种的繁殖用细胞维持液，将新鲜脾毒制成病毒悬 液，接种生长良好的上述细胞系单层，继续培养；每隔4—5日收获换 液一次，取二收、三收细月包培养毒液作为生产用毒种；细胞毒种鉴定细胞毒种鉴定完全符合猪瘟兔化弱毒抹毒种标 准，对猪安全无副作用，细胞毒种每lml含病毒》500，000个家兔感 染量；(4 )制苗毒液的繁殖取已形成良好单层的上述细胞系培养瓶， 弃去细胞生长液，接种含猪瘟兔化弱毒的维持液，继续培养；接毒后 第5日作第一次收获换液，以后每隔4日收获换液l次，收获的毒液 置-15。C以下保存；制苗毒液的检验按《中华人民共和国兽药典》(2005年版) 附录15、 19页进行检验，应无细菌、霉菌、支原体生长。细胞毒液 对猪安全无副作用，各收次病毒培养液分别用家兔测定，每lml含病 毒> 500, OOO个家兔感染量；(5)配苗、分装及冻干将检验合格的病毒培养液，混合于同 一容器内，加入稳定剂，同时加入抗生素，充分摇匀，定量分装；每 头份含细胞毒液不少于0. 015ml，分装后迅速进行冷冻真空干燥后即 得成品。成品检验按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)进行检 验，应符合猪瘟活疫苗(细胞源)规定，对猪安全无副作用。每 头份疫苗含病毒>7500个家兔感染量。本专利技术是用细胞系(ST、 PK15、 IBRS-2 )培养猪瘟兔化弱毒，收 获细胞病毒液，加适宜稳定剂，经冷冻真空干燥制成细胞系猪瘟活疫苗。上述技术方案中，(1)步骤中的细胞系为猪睾丸(ST)细胞系、 猪肾(PK15)细胞系、猪肾(IBRS-2)细胞系之一。上述技术方案中，步骤(2) 、 (3) 、 (4)中所述的细胞培养 温度是36一37。C。上述技术方案中，步骤(3 )及(4 )中所述的接种量为含3%—5% 生产用细胞毒种或0. 2%—0. 5%脾毒种的维持液。上述技术方案中，步骤(2)中所用生长液的配方是90%—92% MEM液、8%—10%犊牛血清、加适量的抗菌素，pH值调整为7. 0—7. 2。上述技术方案中，步骤(3)及(4)中所用维持液的配方是95%一98 。/oMEM液、2°/。一5%犊牛血清、加适量的抗菌素，pH值调整为7. 2一7. 4。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果 (1)用细胞系替代牛睾丸原代细胞制造猪瘟活疫苗，可解决牛 源外源病原污染的问题，通过原材料和培养条件的严格控制，保证生 产出来的疫苗纯粹，确保疫苗的安全性。(2 )采用本专利技术培养的猪瘟细胞毒液病毒含量高，用高滴度的 抗原制造的猪瘟活疫苗可以大大提高疫苗的免疫效力，经免疫攻毒试 -险结果显示，对猪瘟强毒攻击可100%保护。(3)用细胞系生产猪瘟活疫苗各批间质量差异小，具有生产工 艺简单稳定、易操作、产量大、成本低等特点，具备工业化大生产的 可^f亍性和可i文大性，具有4艮好的经济效益和应用前景。附图说明图1为本专利技术的制备流禾呈图。具体实施例以下结合说明书附图及具体实施例来对本专利技术作进一步的描述。 实施例1(1)制苗用细胞的选择选用猪睾丸(ST)细胞系；(2 )制苗用细胞的传代与培养ST细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液于36。C继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；(3)细胞毒种的繁殖用细胞维持液，将新鲜脾毒制成O. 3%的病毒悬液，接种生长良好的ST细胞系单层，置36。C继续培养。每隔4日收获换液一次，取二收、三收细胞培#~4液作为生产用毒种； 细胞毒种鉴定细胞毒种鉴定完全符合猪瘟兔化弱毒林毒种标准，对猪安全无副作用，细胞毒种每lml含病毒》500，000个家兔感染量；(4 )制苗毒液的繁殖取已形成良好单层的ST细胞系培养瓶， 弃去营养液，接种含3%生产用细胞毒种或0. 2%脾毒种的维持液，置 36。C继续培养，接毒后第5日作第一次收获换液，以后每隔4日收获 换液1次，收获的毒液置-15。C以下保存；制苗毒液的检验按《中华人民共和国兽药典》(2005年版) 附录15、 19页进行检验，应无细菌、霉菌、支原体生长。细胞毒液 对猪安全无副作用，各收次病毒培养液分别用家兔测定，每lml含病 毒> 500， OOO个家兔感染量；(5)配苗、分装及冻干将检验合格的病毒培养液，混合于同 一容器内，^換一定的比例加入适宜稳定剂，同时加入适量的抗生素， 充分摇匀，定量分装，每头份含细胞毒液不少于0. 015ml，分装后迅 速进行冷冻真空干燥后即得成品。成品检验按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)进行检 验，应符合猪痘活疫苗(细胞源)规定，对猪安全无副作用。每 头份疫苗含病毒> 7500个家兔感染量。上述所用营养液的配方是90。/。MEM液、10%犊牛血清、加适量的 抗菌素，pH值调整为7.0。上述所用维持液的配方是95。/。MEM液、5%犊牛血清、加适量的 抗菌素，pH值调整为7.2。实施例2(1) 制苗用细胞的选择选用猪肾(PK15)细胞系；(2) 制苗用细胞的传代与培养PK15细胞系经EDTA-胰酶细胞 M液消化传代，以细胞生长液千37。C继续培养，形成良好单层时， 用于继续传代或接种病毒；(3) 细胞毒种的繁殖用细胞维持液，将新鲜脾毒制成0. 4%的 病毒悬液，4妻种生长良好的PK15细胞系单层，置37。C继续培养。每 隔5日收获换液一次，取二收、三收细胞培M液作为生产用毒种；细胞毒种鉴定细胞毒种鉴定完全符合猪瘟兔化弱毒林毒种标 准，对猪安全无副作用，细胞毒种每lml含病毒》500， 000个家兔感染量；(4 )制苗毒液的繁殖取已形成良好单层的PK15细胞系培养瓶， 弃去营养液，接种含4%生产用细胞毒种或0. 3%脾毒种的维持液，置 37。C继续培养，接毒后第5日作第一次收获换液，以后每隔4日收获 换液1次，收获的毒液置-15。C以下保存；制苗毒液的检验按《中华人民共和国兽药典》(2005年版) 附录15、 19页进行4全验，应无细菌、霉菌、支原体生长。细胞毒液 对猪安全无副作用，各收次病毒培养液分别用家兔测定，每lml含病 毒> 500， OOO个家兔感染量；(5)配苗、分装及冻干将检验合格的病毒培养液，混合于同 一容器内，按一定的比例加入适宜稳定剂，本文档来自技高网...

【技术保护点】
用细胞系生产猪瘟活疫苗的方法，其特征在于：包括如下技术步骤：（１）选择细胞系作为制苗用细胞：（２）制苗用细胞的传代与培养：上述细胞系经ＥＤＴＡ－胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种 病毒；（３）细胞毒种的繁殖：用细胞维持液，将新鲜脾毒制成病毒悬液，接种生长良好的上述细胞系单层，继续培养；每隔４～５日收获换液一次，取二收、三收细胞培养毒液作为生产用毒种；（４）制苗毒液的繁殖：取已形成良好单层的上述细胞系培 养瓶，弃去细胞生长液，接种含猪瘟兔化弱毒的维持液，继续培养；接毒后第５日作第一次收获换液，以后每隔４日收获换液１次，收获的毒液置－１５℃以下保存；（５）配苗、分装及冻干：将检验合格的病毒培养液，混合于同一容器内，加入稳定剂，同时加入 抗生素，充分摇匀，定量分装；每头份含细胞毒液不少于０．０１５ｍｌ，分装后迅速进行冷冻真空干燥后即得成品。

【技术特征摘要】
1.用细胞系生产猪瘟活疫苗的方法，其特征在于包括如下技术步骤(1)选择细胞系作为制苗用细胞(2)制苗用细胞的传代与培养上述细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；(3)细胞毒种的繁殖用细胞维持液，将新鲜脾毒制成病毒悬液，接种生长良好的上述细胞系单层，继续培养；每隔4～5日收获换液一次，取二收、三收细胞培养毒液作为生产用毒种；(4)制苗毒液的繁殖取已形成良好单层的上述细胞系培养瓶，弃去细胞生长液，接种含猪瘟兔化弱毒的维持液，继续培养；接毒后第5日作第一次收获换液，以后每隔4日收获换液1次，收获的毒液置-15℃以下保存；(5)配苗、分装及冻干将检验合格的病毒培养液，混合于同一容器内，加入稳定剂，同时加入抗生素，充分摇匀，定量分装；每头份含细胞毒液不少于0.015ml，分装后迅速进行冷冻真空干燥后即得成品。2. 根据权利要求1所述的用细胞系生产猪瘟...

【专利技术属性】
技术研发人员：宁宜宝，吴文福，林旭埜，张毓金，李嘉爱，赖月辉，张国丽，岑小清，游启有，王少英，司徒剑谋，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，广东永顺生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]