【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术提供的主题涉及与感兴趣的蛋白连接,或者能够与感兴趣的蛋 白连接的核酸标签。具体的,本专利技术提供的主题涉及包含报告子功能和蛋 白标记功能的寡核苷酸。本专利技术还提供核酸标签组合物、试剂盒及其使用 方法。
技术介绍
定量和检测蛋白存在的传统技术包括凝胶电泳、Western印迹、基于 ELISA的免疫吸附检测和蛋白质微阵列。每种此类方法都是繁琐并且难以 适用于高通量用途。这些传统方法还存在检测灵敏度和特异性的限制。本 专利技术提供了核酸标签,以及利用所述核酸标签的新的、高灵敏度和选择性 的蛋白质检测方法。专利技术简迷本专利技术提供了与蛋白连接,或者能够与蛋白连接的核酸标签,其允许 高灵敏度地检测蛋白质。在一实施方案中,所述核酸标签是具有报告子功 能和蛋白标记功能的寡核苷酸。在一实施方案中,所述寡核苷酸(寡聚物) 是包括第 一核酸序列和第二核酸序列的寡核苷酸,所述第 一核酸序列是 PCR探针可识别的PCR扩增序列(扩增子),所述第二核酸序列共价连接、 非共价连接、形成复合体或者以其它方式结合(例如结合或能够结合)感20兴趣的蛋白。在某些实施方案中,所述扩增子是随机产生的、非天然存在 的PCR扩增序列。在一实施方案中,所述第一核酸序列和/或第二核酸序 列不是活生物体内源性的。在其它实施方案中,第一核酸序列和/或第二核 酸序列是活生物体内源性的。在某些实施方案中,所述第一核酸序列和所 述第二核酸序列是异源的。如本专利技术使用的,如果两条核酸序列是异源 的,是指一般不同时发现第一和第二核酸序列。例如,在某些实施方案 中,所述第 一和第二核酸序列不编码相同的 ...
【技术保护点】
结合核酸相互作用基序的核酸寡聚物,其中所述核酸寡聚物包含: (a)是PCR扩增序列的第一核酸序列,和 (b)结合所述核酸相互作用基序的第二核酸序列, 其中,所述第一核酸序列与所述第二核酸序列是异源性的。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2006.6.30 US 60/806,4221. 结合核酸相互作用基序的核酸寡聚物,其中所述核酸寡聚物包含(a)是PCR扩增序列的第一核酸序列,和(b)结合所述核酸相互作用基序的第二核酸序列,其中,所述第一核酸序列与所述第二核酸序列是异源性的。2. 权利要求l的寡聚物,其中所述核酸是DNA。3. 权利要求2的寡聚物,其中所述DNA是双链DNA。4. 权利要求l-3中任一项的寡聚物,其中所述核酸相互作用基序是 DNA-结合结构域。5. 权利要求4的寡聚物,其中所述DNA-结合结构域是NF-kB DNA 结合结构域、cro抑制子DNA结合结构域、lac抑制子DNA结合结构域、 GAL4DNA结合结构域、GCN4 DNA结合结构域、Lex-ADNA结合结构 域、Opaque-2 DNA结合结构域、或TGA 1 a DNA结合结构域。6. 权利要求4的寡聚物,其中所述第二核酸序列包含在SEQID NO:7、 SEQIDNO:8、 SEQIDNO:9、 SEQIDNO:ll、 SEQIDNO:14、 SEQIDNO:15、 SEQIDNO:16、 SEQIDNO:17、 SEQIDNO:18、 SEQID NO:19、 SEQIDNO:20、或SEQIDNO:21中描述的序列。7. 权利要求4的寡聚物,其中所迷第二核酸序列包含在SEQID NO:IO、 SEQIDNO:12、或SEQ IDNO:13中描述的序列。8. 权利要求l-7中任一项的寡聚物,其中所述寡聚物的长度在约50 和约500核苷酸之间。9. 权利要求l的寡聚物,其中所迷核酸相互作用基序是融合蛋白,其 中所述融合蛋白包含(a)含有感兴趣的蛋白的第 一 结构域和(b)含有核酸相互 作用基序的第二结构域。10. 核酸寡聚物,其包含结合核酸相互作用基序的核酸序列,其中所 述寡聚物是放射性标记的、荧光标记的或生物素化的。11.权利要求10的寡聚物,其中所述核酸相互作用基序不是放射性标 记的、荧光标记的或生物素化的。12. 权利要求9的寡聚物,其中所述感兴趣的蛋白是跨膜蛋白、跨膜 离子通道蛋白、配体门控离子通道蛋白、核激素受体蛋白、胞外信号分子 或因子、细胞因子、生长因子、激素、酶、抗体、或单链可变区片段 (scFv)。13. 权利要求9的任一项寡聚物,其中所述感兴趣的蛋白是活性构象 的或非活性构象的激酶。14. 权利要求13的寡聚物,其中所述激酶是人激酶。15. 权利要求13的寡聚物,其中所述激酶是非受体酪氨酸激酶。16. 权利要求15的寡聚物,其中所述非受体酪氨酸激酶是ABL、 ACK、 CSK、 MATK、 FAK、 PYK2、 FES、 FRK、 JAK、 SRC-A、 SRC-B、 TEC或SYK酪氨酸激酶家族的成员。17. 权利要求13的寡聚物,其中所述激酶是受体酪氨酸激酶。18. 权利要求17的寡聚物,其中所述受体酪氨酸激酶是ALK、 AXL、 DDR、 EGFR、 EPH、 FGFR、 INSR、 MET、 MUSK、 PDGFR、 PTK7、 RET、 ROR、 ROS、 RYK、 TIE、 TRK、 VEGFR、 AATYK或 SuRTK106酪氨酸激酶家族的成员。19. 核酸寡聚物,包含在SEQIDNO:l、 SEQIDNO:2、 SEQIDNO:3 或SEQIDNO:4中描述的核苷酸序列。20. 融合蛋白,包含(a) 包含感兴趣的蛋白的第一结构域,和(b) 包含核酸相互作用基序的第二结构域,其中,所述感兴趣的蛋白和所述核酸相互作用基序互不相同,并且其 中所述核酸相互作用基序结合权利要求1-19的任一项的核酸寡聚物。21. 权利要求20的融合蛋白,其中所述核酸相互作用基序是DNA-结 合结构域。22. 权利要求21的融合蛋白,其中所述DNA-结合结构域是NF-KB DNA结合结构域、cro抑制子DNA结合结构域、lac抑制子DNA结合结 构域、GAL4DNA结合结构域、GCN4 DNA结合结构域、Lex-ADNA结 合结构域、Opaque-2 DNA结合结构域、或TGA la DNA结合结构域。23. 权利要求20的融合蛋白,其中所述第二结构域包含在SEQID NO:5或SEQIDNO:6中描述的氨基酸序列。24. 权利要求20的融合蛋白,其中所述感兴趣的蛋白是跨膜蛋白、跨 膜离子通道蛋白、配体门控离子通道蛋白、核激素受体蛋白、胞外信号分 子或因子、细胞因子、生长因子、激素、酶、抗体、或单链可变区片段 (scFv)。25. 权利要求20的融合蛋白,其中所述感兴趣的蛋白是活性构象的或 非活性构象的激酶。26. 权利要求25的融合蛋白,其中所述激酶是人激酶。27. 权利要求26的融合蛋白,其中所述激酶是非受体酪氨酸激酶。28. 权利要求27的融合蛋白,其中所述非受体酪氨酸激酶是ABL、 ACK、 CSK、 MATK、 FAK、 PYK2、 FES、 FRK、 JAK、 SRC-A、 SRC-B、 TEC或SYK酪氨酸激酶家族的成员。29. 权利要求25的融合蛋白,其中所述激酶是受体酪氨酸激酶。30. 权利要求29的融合蛋白,其中所述受体酪氨酸激酶是ALK、 AXL、 DDR、 EGFR、 EPH、 FGFR、 INSR、 MET、 MUSK、 PDGFR、 PTK7、 RET、 ROR、 ROS、 RYK、 TIE、 TRK、 VEGFR、 AATYK或 SuRTK106酪氨酸激酶家族的成员。31. 权利要求20-30的任一项的融合蛋白,其中所述融合蛋白与所述 核酸寡聚物复合、共价地或非共价地连接。32. 融合蛋白的文库,包含多种权利要求20-33的任一项的融合蛋 白,其中至少两种或多种融合蛋白互不相同。33. 寡聚物的文库,包含多种权利要求1-19的任一项的寡聚物,其中 至少两种或多种寡聚物互不相同。34. 编码权利要求20-31的任一项的融合蛋白的核酸。35. 包含权利要求34的核酸的载体。36. 包含权利要求35的载体的宿主细胞。37. 权利要求36的宿主细胞,其中所述宿主细胞是细菌、昆虫、哺乳 动物或植物宿主细胞。38. 用于鉴别结合配体的感兴趣的蛋白的方法,包括将固定在固体支持物上的配体与融合蛋白接触,所述融合蛋白包含(a) 包含感兴趣的蛋白的第 一结构域,和(b)包含核酸相互作用基序的第二结构 域,其中所述感兴趣的蛋白和所述核酸相互作用基序互不相同;添加核酸寡聚物,所述核酸寡聚物包含与融合蛋白的核酸相互作用基 序结合的核酸序列;去除未结合的核酸寡聚物和/或未结合的融合蛋白;和检测所述核酸寡聚物是否与所述融合蛋白结合;由此通过检测结合的核酸寡聚物来表明所述感兴趣的蛋白与所述配体<formula>formula see original document page 7</formula>39. 鉴别结合感兴趣的蛋白的测试化合物的方法,包括在存在或缺少测试化合物的条件下,将结合感兴趣的蛋白的固定化参 照配体与融合蛋白接触,所述融合蛋白包括(a)包含感兴趣的蛋白的第 一结 构域,和(b)包含核酸相互作用基序的第二结构域,其中所述感兴趣的蛋白 和所述核酸相互作用基序互不相同;添加核酸寡聚物,所述核酸寡聚物包含与融合蛋白的核酸相互作用基 序结合的核酸序列;去除未结合的核酸寡聚物和/或未结合的融合蛋白;和检测所述核酸寡聚物是否与所述融合蛋白结合;其中,与缺失测试化合物的条件下相比,在存在测试化合物的条件 下,与固定化参照配体结合的融合蛋白量的降低表明了所述测试化合物与 所述感兴趣的蛋白结合。40. 鉴别与具有ATP-结合位点的感兴趣的蛋白结合的测试化合物的方法,其中所述测试化合物是感兴趣的蛋白的非-ATP竟争性结合剂,该方 法包括在(i)存在和缺少测试化合物,和(ii)存在和缺少外源性ATP的条件 下;将结合感兴趣的蛋白的固定化参照配体与融合蛋白接触,所述融合蛋 白包括(a)包含感兴趣的蛋白的第 一 结构域,和(b)包含核酸相互作用基序的 第二结构域,其中所述感兴趣的蛋白和所述核酸相互作用基序互不相同;添加核酸寡聚物,所述核酸寡聚物包含与融合蛋白的核酸相互作用基 序结合的核酸序列;去除未结合的核酸寡聚物和/或未结合的融合蛋白;和检测所述核酸寡聚物是否与所述融合蛋白结合;其中,(i)与缺失测试化合物和缺少ATP的条件下相比,在存在测试化 合物并缺少ATP的条件下,与固定化参照配体结合的融合蛋白量的降低表 明了测试化合物与感兴趣的蛋白结合;和其中(ii)与存在测试化合物并缺少ATP的条件下相比,在存在测试 化合物并存在ATP的条件下,与融合蛋白结合的核酸寡聚体的量的增加表 明了测试化合物是感兴趣的蛋白的非-ATP竟争性结合剂。41. 确定测试化合物对感兴趣的蛋白的Kd值的方法,包括 在存在不同浓度的测试化合物,和缺少测试化合物的条件下,将结合感兴趣的蛋白的固定化参照配体与融合蛋白接触,所述融合蛋白包括(a)含 有感兴趣的蛋白的第 一 结构域,和(b)含有核酸相互作用基序的第二结构 域,其中所述感兴趣的蛋白和所述核酸相互作用基序互不相同;添加核酸寡聚物,所述核酸寡聚物包含与融合蛋白的核酸相互作用基序结合的核酸序列;去除未结合的核酸寡聚物和/或未结合的融合蛋白;和在每种不同浓度的测试化合物和缺少测试化合物的条件下,通过检测或者定量与固体支持物上吸附的融合蛋白相结合的核酸寡聚物,来获得竟争结合曲线;由此测试化合物对感兴趣的蛋白的Kd值是这样的浓度,当存在所述 浓度的测试化合物时,固定化参照配体所吸附的感兴趣的蛋白是缺少测试 化合物时所吸附的感兴趣的蛋白的50%。42. 权利要求38-41的任一项的方法,其中所述核酸寡聚物包括(a)是 PCR扩增序列的第 一核酸序列,和(b)结合核酸相互作用基序的第二核酸序 列,其中所述第一核酸序列与所述第二核酸序列是异源的。43. 权利要求42的方法,还包括qPCR扩增与所述融合蛋白结合的所述核酸寡聚物。44. 权利要求38-41的任一项的方法,其中所述核酸寡聚物是放射性 标记的、荧光标记的或生物素化的。45. 同时鉴别结合两种或多种感兴趣的蛋白的测试化合物的方法,包括在存在和缺少测试化合物的条件下,将结合两种或多种感兴趣的蛋白 中的每一种的固定化参照配体与两种或多种融合蛋白接触,其中,每种融合蛋白独立地包含(a)只含有两种或多种感兴趣的蛋白中的一种的第一结构域,和(b)含有核酸相互作用基序的第二结构域,其中所述感兴趣的蛋白和所述核酸相互作用基序互不相同;添加两种或多种核酸寡聚物,其中,两种或多种核酸寡聚物中的每一 种都包含这样的核酸序列,所述核酸序列独立地只与两种或多种融合蛋白中的 一 种的核酸相互作用基序结合;去除未结合的核酸寡聚物和/或未结合的融合蛋白;和检测或者定量两种或多种核酸寡聚物中的每一种;其中,与缺少测试化合物的条件下相比,在存在测试化合物的条件下,与固定化参照配体结合的两种或多种融合蛋白量的降低,表明测试化合物结合...
【专利技术属性】
技术研发人员:皮艾特罗·奇切里,杰里米·亨特,吉恩迈克尔·A·莱利亚斯,迈克·莫里森,丹尼尔·特莱柏,利萨·M·沃迪科卡,
申请(专利权)人:埃姆比特生物科学公司,
类型:发明
国别省市:US
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