玉米多态性和基因分型的方法技术

多态性玉米ＤＮＡ基因座用于至少两个玉米品种之间的基因分型。所述基因座序列用于设计检测玉米ＤＮＡ中的多态性的引物和探针寡核苷酸。多态性用于玉米中的基因分型应用。多态性标记用于建立标记／性状关联，例如在连锁不平衡定位和关联研究，定位克隆和转基因应用，标记辅助育种和标记辅助选择，杂种预测和遗传同一性研究中。多态性标记还用于定位ＤＮＡ克隆的文库，例如用于与多态性连锁的玉米ＱＴＬ和基因。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术公开了玉米多态性，涉及所述多态性的核酸分子以及使用 所述多态性和分子的方法，例如，在基因分型中。
技术介绍
多态性用作遗传标记，用于农业领域中的基因分型应用，例如， 在植物遗传研究和商业育种中。参见例如美国专利5,385, 835; 5， 437， 697 ; 5， 385， 835; 5， 492， 547; 5， 746， 023; 5， 962， 764; 5， 981， 832和6， 100， 030,所有这些专利的公开内容通过引用并入本 文。DM的高度保守性与极少发生的稳定的多态性相结合提供了遗传 标记，这两者都是可预测的并且都可以辨别不同的基因型。现有的遗 传标记种类之一是指示遗传变异的多种多态性，包括限制性片段长度 多态性(RFLPs )，扩增片段长度多态性(AFLPs )，简单序列重复(SSRs )，6)和插入/缺失多态性(Indels)。用于植物物 种的遗传标记的数量是有限的，因此额外的遗传标记的发现将促进基 因分型应用，包括标记性状关联研究，基因定位，基因发现，标记辅 助选择和标记辅助育种。发展中的技术使得一些遗传标记更适于快速 的，大规模用途。例如，SNP检测技术表明SNP是优选的遗传标记。专利技术概述本专利技术提供了大量的玉米遗传标记。这些遗传标记包括玉米DNA 基因座，其用于至少两种玉米品种之间的基因分型应用。本专利技术的多 态性玉米基因座包含至少20个连续的核苷酸，其包括多态性或与多态 性相邻，所述多态性是本文(例如，表1中)鉴定的多态性。更具体 地，本专利技术的多态性玉米基因座具有这样的核苷酸序列，其与包括多 态性或者与多态性相邻的玉米DNA片段的任一条链中的相同核苷酸数 量的序列至少90%，优选至少95°/。同一。如在表l中所示，SEQIDN0: 1至SEQIDN0: 10373的核酸序列包含一个或多个多态性，例如，单 核苷酸多态性(SNPs)和插入/缺失多态性(Indels)。在本专利技术的一个方面中，在一个或多个DNA序列的数据组中提供 了多态性玉米基因座，即数据组包含高达限定数量的不同序列的多态 性基因座。数据组中的限定数量的多态性基因座可以少至2个或高达 1000个以上或更多，例如，5、 10、 25、 40、 75、 100或500个基因座。 此类数据组用于大规模的或包括大量的植物的基因分型应用。在本发 明的一个有用的方面中，多态性玉米基因座的数据组记录在计算机可 读介质上。在本专利技术的另一个方面中，将本专利技术的基因座中的多态性定位在 玉米基因组上，例如，作为包含两个或多个多态性的图谱位置的玉米 基因组的遗传图镨，如表1中所示，更优选如表3中所示。此类遗传 图谱在附图说明图1中说明。遗传图谱数据还可以记录在计算机可读介质上。 本专利技术的优选实施方案提供高密度的多态性遗传图镨，例如，至少150 个或更多，比如说至少500个或1000个，跨越玉米基因组图傳的多态7性。特别地，有用的遗传图语包含在连锁群上平均距离不多于IO厘摩 (cM)的多态性。本专利技术还提供了用于鉴定多态性的核酸分子，此类分子优选是寡 核苷酸，其用作用于扩增玉米基因组片段(例如，多态性基因座)的 PCR引物，和用于在玉米DM中鉴定特定多态性的存在或缺失的测定 的杂交探针。通常，用作PCR引物的核酸分子是成对提供的，用于扩增包含至 少 一个多态性的玉米DNA片段，其中各个分子包含至少15个核苷酸碱 基。引物分子之一的核苷酸序列与多态性基因座中的玉米DNA片段的 一条链中的相同连续核苷酸数量的序列优选至少90%同一。优选地， 引物可以在高严紧条件下与多态性基因座DNA的链杂交。优选地，成 对地提供和使用此类引物，所述引物在多态性基因座中的玉米DNA片 段中的至少一个多态性的侧翼。用作杂交探针的核酸分子，用于检测玉米DM中的多态性，其可 以针对多种测定进行设计。为测定目的(其中探针意欲于与包括多态 性的片段杂交)，此类分子可以包含至少12个核苷酸碱基和可检测的 标记。核苷酸碱基的序列与本专利技术的多态性基因座中的玉米DNA片段 的任一条链中相同连续核苷酸数量的序列优选至少90%同一，更优选 至少95%同一。本专利技术优选的方面中，可检测的标记是位于所述分子 的一个末端的染料。在更优选的方面中，所述分子在其末端包含染料 和染料淬灭剂。就SNP测定而言，成对提供此类分子是有用的，例如， 其中各个分子在5，端具有不同的荧光染料并且除单核苷酸多态性以外具有相同的核苷酸序列。为了测定目的(其中分子设计为杂交于多态性邻近，所述多态性 通过单碱基延伸检测，例如，标记的双脱氧核苷酸的单碱基延伸)， 此类分子可以在序列中包含至少15个，更优选至少16个或17个核苷 酸碱基，所述序列与多态性玉米DM片段的任一条链中的相同连续核 苷酸数量的序列至少90%同一，优选至少95%同一。本专利技术的另一方面是杂交探针和玉米基因组DM片段的复合物。8本专利技术另 一方面提供了寡核苷酸组，其包含用于PCR扩增多态性 玉米DM片段的核酸分子引物对，和用于检测所述片段中的多态性的 至少一个检测核酸分子。此类组以至少2组或高达1000组或更多，例 如，高达5、 10、 25、 40、 75、 100或500组的引物对和杂交探针的集 合形式提供。本专利技术的另一方面提供了用于确定多态性的方法，就真核基因组 中的基因分型应用而言，所述多态性作为标记很可能是有用的。此类 方法包括通过分离来自一个物种的至少两个品种的基因组DM片段的 重复序列，基于核苷酸序列的大小将分离的基因组DNA片段分开，并 且比较级分中的片段的序列以确定多态性来构建约化表示文库(reduced representation 1 ibraries )。更具体地,鉴定基因组DNA 中的多态性的方法包括用甲基化敏感的核酸内切酶消化来自 一个真核 物种的至少两个品种的总基因组DNA,以提供经消化的DM片段的库(pool)。对于由更低百分比的5-曱基化胞嘧啶表征的DNA区域，片 段的平均核苷酸长度更小。此类片段是可分离的，例如，通过凝胶电 泳，基于核苷酸长度。具有少于平均核苷酸长度的DNA级分分离自经 消化的DNA库。比较级分中的DNA序列以鉴定多态性。与编码序列相 比，重复序列更可能包含5-甲基化胞嘧啶，例如在-CG-和-CNG序列片 段中。在该方法优选的一个方面中，用甲基化敏感的核酸内切酶消化 来自一种作物的至少两种不同的近交品种的基因组DM,所述核酸内切酶选自由Aci I， Apa I， Age I, Bsr F I, BssH II， Eag I， Eae I， Hha I， HinPl I， Hpa II, Msp I， MspM II， Nar I, Not I， Pst I， Pvu I， Sac II， Sma I, Stu I和Xho I组成的组，以提供一皮物理分 离(例如，通过凝胶电泳)的经消化的MA库。相当大小的DM级分 获得自各个所述品种的经消化的DM。将来自相当级分的DM分子插 入到载体中以构建基因组DNA克隆的约化表示文库，对其进行测序和 比较，以鉴定多态性。在可选择的方法中，通过用核酸内切酶消化来自一个真核物种的 至少两个品种的总基因组DM以提供经消化的DNA片段的库，从而鉴定基本文档来自技高网...

【技术保护点】
多态性玉米ＤＮＡ基因座，其用于至少两个玉米品种之间的基因分型：其中所述的基因座包含至少２０个连续的核苷酸，其包括或与表１中鉴定的多态性相邻；并且其中所述的至少２０个连续的核苷酸的序列与玉米ＤＮＡ片段的任一条链中的相同核苷酸数量的序列至少９０％同一，所述的玉米ＤＮＡ片段包括或与所述的多态性相邻。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：D比特吕耶，C劳里，A古普塔，D约翰逊，S伊锡顿，J布尔，M爱德华兹，
申请(专利权)人：孟山都技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]