【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于植物中RNA模板化编辑的组合物和方法
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[0002]提供根据37 C.F.R.
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专利
[0003]本专利技术涉及包含DNA结合结构域、内切核酸酶和逆转录酶的重组核酸构建体及其用于修饰植物中的核酸的方法。
[0004]专利技术背景
[0005]碱基编辑已被证明是将胞嘧啶和腺嘌呤残基分别改变为胸腺嘧啶和鸟嘌呤的有效方法。这些工具虽然功能强大，但确实有一些限制，例如旁观者碱基、小碱基编辑窗口，除非具有高PAM密度的酶可以补偿，否则对性状相关靶的可及性有限，将胞嘧啶和腺嘌呤分别转化为除胸腺嘧啶和鸟嘌呤之外的残基的能力有限，并且没有编辑胸腺嘧啶或鸟嘌呤残基的能力。因此，目前可用于碱基编辑的工具是有限的，特别是在植物中。因此，为了使核酸编辑在包括植物在内的更多生物中更有用，需要新的编辑工具。
[0006]专利技术概述
[0007]本专利技术的第一方面涉及一种修饰植物细胞中的靶核酸的方法，该方法包括：使靶核酸与以下接触：(a)DNA结合结构域(例如，第一DNA结合结构域)；(b)DNA内切核酸酶(例如，第一DNA内切核酸酶)；和(c)逆转录酶(例如，第一逆转录酶)，从而修饰植物...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种修饰植物细胞中的靶核酸的方法，该方法包括：使靶核酸与以下接触：(a)DNA结合结构域(例如，第一DNA结合结构域)；(b)DNA内切核酸酶(例如，第一DNA内切核酸酶)；和(c)逆转录酶(例如，第一逆转录酶)，从而修饰植物细胞中的靶核酸。2.根据权利要求1所述的方法，其中(a)DNA结合结构域；(b)DNA内切核酸酶；和(c)逆转录酶包含在复合物(例如，核糖核蛋白复合物)中。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中DNA结合结构域是DNA结合融合蛋白，其包含融合(例如，连接)至肽标签(例如，肽重复单元、表位或多聚化表位)的DNA结合蛋白结构域，和/或，DNA内切核酸酶是DNA内切核酸酶融合蛋白，其包含融合(例如，连接)至肽标签(例如，肽重复单元、表位或多聚化表位)的DNA内切核酸酶结构域，并且逆转录酶是逆转录酶融合蛋白，其包含融合例如(连接)至与肽标签结合的亲和多肽的逆转录酶结构域，任选地其中靶核酸与两种或更多种逆转录酶融合蛋白接触。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中DNA结合结构域是CRISPR
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Cas核酸酶结构域、转录激活因子样效应(TALE)蛋白结构域和/或锌指蛋白结构域。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中DNA内切核酸酶是CRISPR
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Cas核酸酶和/或Fok1内切核酸酶。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中DNA结合结构域(a)和DNA内切核酸酶(b)包含在CRISPR
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Cas核酸酶中。7.根据权利要求5或6中任一项所述的方法，其中CRISPR
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Cas核酸酶是Cas9切口酶(nCas9)或Cas12a。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中DNA结合结构域是CRISPR
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Cas核酸酶，其包含在一个或多个核酸酶活性位点中(例如，在RuvC结构域中、在HNH结构域中)的突变，(例如，失活的或deadCas(dCas))，任选地dCas9或dCas12a。9.根据权利要求8所述的方法，其中DNA内切核酸酶是Fok1内切核酸酶。10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其还包括使靶核酸与延伸指导核酸接触，其中延伸指导核酸包含延伸部分，所述延伸部分包含引物结合位点和逆转录酶模板，所述逆转录酶模板任选地相对于靶核酸具有超过50个异源性核苷酸和/或相对于靶核酸具有超过15个同源性核苷酸，任选地其中延伸指导核酸包含在表达盒中，任选地其中延伸指导核酸可操作地连接至PolII启动子。11.根据权利要求10所述的方法，其中延伸指导核酸连接至RNA募集基序，并且逆转录酶是逆转录酶融合蛋白，其包含融合(例如，连接)至与RNA募集基序结合的亲和多肽的逆转录酶结构域，任选地其中靶核酸与两种或更多种逆转录酶融合蛋白接触。12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中DNA结合结构域、DNA内切核酸酶和逆转录酶各自由多核苷酸编码。13.根据权利要求12所述的方法，其中编码DNA结合结构域的多核苷酸、编码DNA内切核酸酶的多核苷酸和编码逆转录酶的多核苷酸包含在相同或分开的表达盒中，任选地其中，当存在于相同的表达盒中时，编码DNA结合结构域的多核苷酸、编码DNA内切核酸酶的多核苷酸和编码逆转录酶的多核苷酸可操作地连接至单个启动子或连接至任意组合的两个或
更多个分开的启动子。14.根据权利要求13所述的方法，其中相同或分开的表达盒包含在一个或多个载体中。15.根据权利要求13或14所述的方法，其中相同或分开的表达盒和/或一个或多个载体包含延伸指导RNA。16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其还包括使靶核酸与第二DNA结合结构域、第二DNA内切核酸酶和编码RNA的模板接触。17.根据权利要求16所述的方法，其中第二DNA结合结构域、第二DNA内切核酸酶和第二逆转录酶包含在复合物中。18.根据权利要求16或权利要求17所述的方法，其还包括使靶核酸与指导核酸接触。19.根据权利要求17或18所述的方法，其中第二DNA结合结构域是第二DNA结合融合蛋白，其包含融合(例如，连接)至肽标签(例如，肽重复单元、表位或多聚化表位)的第二DNA结合蛋白结构域，和/或，第二DNA内切核酸酶是第二DNA内切核酸酶融合蛋白，其包含融合(例如，连接)至肽标签(例如，肽重复单元、表位或多聚化表位)的第二DNA内切核酸酶结构域，并且第二逆转录酶是第二逆转录酶融合蛋白，其包含融合(例如，连接)至与肽标签结合的亲和多肽的第二逆转录酶结构域，任选地其中靶核酸与两种或更多种第二逆转录酶融合蛋白接触。20.根据权利要求18或19所述的方法，其中延伸指导核酸连接至RNA募集基序，并且第二逆转录酶是第二逆转录酶融合蛋白，其包含融合(例如，连接)至与RNA募集基序结合的亲和多肽的第二逆转录酶结构域，任选地其中靶核酸与两种或更多种第二逆转录酶融合蛋白接触。21.根据权利要求16至20中任一项所述的方法，其中第二DNA结合结构域是CRISPR
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Cas核酸酶结构域、转录激活因子样效应(TALE)蛋白结构域和/或锌指蛋白结构域。22.根据权利要求16至21中任一项所述的方法，其中第二DNA内切核酸酶是CRISPR
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Cas核酸酶和/或Fok1内切核酸酶。23.根据权利要求16至22中任一项所述的方法，其中第二DNA结合结构域和第二DNA内切核酸酶包含在CRISPR
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Cas核酸酶中。24.根据权利要求16至23中任一项所述的方法，其中CRISPR
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Cas核酸酶是Cas9切口酶(nCas9)或Cas12切口酶，任选地其中Cas9或Cas12切口酶由任选地包含在表达盒中的多核苷酸编码。25.根据权利要求16至24中任一项所述的方法，其中第二DNA结合结构域和第二DNA内切核酸酶各自由多核苷酸编码。26.根据权利要求25所述的方法，其中编码第二DNA结合结构域的多核苷酸和编码第二DNA内切核酸酶的多核苷酸包含在相同或分开的表达盒中，任选地其中当存在于相同的表达盒中时，编码第二DNA结合结构域的多核苷酸和编码第二DNA内切核酸酶的多核苷酸可操作地连接至单个启动子或连接至任意组合的两个或更多个分开的启动子。27.根据权利要求26所述的方法，其中相同或分开的表达盒包含在一个或多个载体中。28.根据权利要求26或权利要求27所述的方法，其中相同或分开的表达盒和/或一个或多个载体包含指导RNA。29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其还包括使靶核酸与5'瓣内切核酸酶
(FEN)、任选地FEN1多肽接触。30.根据权利要求29所述的方法，其中FEN在植物或植物细胞中过表达。31.根据权利要求29或30所述的方法，其中FEN是融合蛋白，其包含融合至DNA结合结构域和/或DNA内切核酸酶的FEN结构域。32.根据权利要求29至31中任一项所述的方法，其中DNA结合结构域是DNA结合融合蛋白，其包含融合(例如，连接)至肽标签(例如，肽重复单元、表位或多聚化表位)的DNA结合蛋白结构域，和/或，DNA内切核酸酶是DNA内切核酸酶融合蛋白，其包含融合(例如，连接)至肽标签(例如，肽重复单元、表位或多聚化表位)的DNA内切核酸酶结构域，并且FEN是FEN融合蛋白，其包含融合(连接)至与肽标签结合的亲和多肽的FEN结构域，任选地其中靶核酸与两种或FEN融合蛋白接触，从而将FEN募集到DNA结合蛋白和/或DNA内切核酸酶，和靶核酸。33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中逆转录酶融合至一个或多个单链RNA结合结构域(RBD)。34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中编码DNA结合结构域、内切核酸酶、逆转录酶、瓣内切核酸酶的多核苷酸、延伸指导核酸、指导核酸、表达盒和/或载体针对在植物中的表达进行密码子优化。35.根据权利要求34所述的方法，其中密码子优化是针对在双子叶植物中的表达。36.根据权利要求34所述的方法，其中密码子优化是针对在单子叶植物中的表达。37.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中肽标签包括2个或更多个拷贝的肽重复单元。38.根据权利要求37所述的方法，其中肽重复单元是GCN4肽重复单元(例如，Sun
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Tag)、c
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Myc亲和标签、HA亲和标签、His亲和标签、S亲和标签、甲硫氨酸
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His亲和标签、RGD
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His亲和标签、FLAG八肽、strep标签或strep标签II、V5标签和/或VSV
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G表位。39.根据权利要求3至38中任一项所述的方法，其中亲和多肽是抗体。40.根据权利要求39所述的方法，其中抗体是scFv抗体。41.根据权利要求10至40中任一项所述的方法，其中延伸指导RNA和/或指导RNA可连接至两个或更多个RNA募集基序，任选地其中两个或更多个RNA募集基序可为相同的RNA募集基序或不同的RNA募集基序。42.根据权利要求41所述的方法，其中RNA募集基序是端粒酶Ku结合基序(例如，Ku结合发夹)并且亲和多肽是Ku(例如，Ku异二聚体)；RNA募集基序是端粒酶Sm7结合基序并且亲和多肽是Sm7；RNA募集基序是MS2噬菌体操纵子茎环并且亲和多肽是MS2包被蛋白(MCP)；RNA募集基序是PP7噬菌体操纵子茎环并且亲和多肽是PP7包被蛋白(PCP)；RNA募集基序是SfMu噬菌体Com茎环并且亲和多肽是Com RNA结合蛋白；或RNA募集基序是合成的RNA
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适配体并且亲和多肽是相应的适配体配体。43.一种针对在植物中的表达进行密码子优化的表达盒，其从5'至3'包含：(a)编码植物特异性启动子序列(例如，ZmUbi1、MtUb2、RNA聚合酶II(PolII)等)的多核苷酸；(b)编码CRISPR
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Cas核酸酶(例如，nCas9、dCas9、Cpf1(Cas12a)、dCas12a等)的针对植物进行密码子优化的多核苷酸；(c)接头序列；和
(d)编码逆转录酶的针对植物进行密码子优化的多核苷酸。44.根据权利要求43所述的方法，其中逆转录酶融合至一个或多个单链RNA结合结构域(RBD)。45.根据权利要求43或权利要求44的表达盒，其中接头是氨基酸或肽接头。46.根据权利要求45所述的表达盒，其中肽接头的长度为约2个至约100个氨基酸(残基)。47.根据权利要求45或权利要求46所述的表达盒，其中肽接头是GS接头。48.一种针对在植物中的表达进行密码子优化的表达盒，其包含：(a)编码植物特异性启动子序列(例如，ZmUbi1、MtUb2)的多核苷酸，和(b)延伸指导核酸，其中延伸指导核酸包含延伸部分，所述延伸部分在其3
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端包含引物结合位点和待并入靶核酸中的编辑(例如，任选地相对于靶核酸具有超过50个异源性核苷酸和/或相对于靶核酸具有超过15个同源性核苷酸的逆转录酶模板)，任选地其中延伸指导核酸包含在表达盒中，任选地其中延伸指导核酸可操作地连接至PolII启动子。49.根据权利要求45至48中任一项所述的表达盒，其中植物特异性启动子序列与内含子相关联或者是包含内含子的启动子区(例如，包含内含子的ZmUbi1；包含内含子的MtUb2)。50.根据权利要求45至49中任一项所述的表达盒，其中密码子优化是针对在双子叶植物中的表达。51.根据权利要求45至50中任一项所述的表达盒，其中密码子优化是针对在单子叶植物中的表达。52.一种修饰植物或植物细胞中的靶核酸的方法，其包括将权利要求45至51中任一项所述的表达盒引入植物或植物细胞中，从而修饰植物或植物细胞中的靶核酸。53.根据权利要求52所述的方法，其还包括再生包含修饰的靶核酸的植物细胞以产生包含修饰的靶核酸的植物。54.一种修饰植物细胞中的靶核酸的方法，其包括使靶核酸与以下接触：靶向靶核酸上第一位点的DNA结合结构域和DNA内切核酸酶结构域以及靶向靶核酸上第二位点的相同或不同的DNA结合结构域和DNA内切核酸酶结构域，其中第一位点和第二位点在相同(非靶)链上彼此接近，从而将靶核酸在第一和第二位点处造成切口；逆转录酶；和编码修复模板的核酸，其编码待并入靶核酸的修饰，从而修饰植物中的靶核酸。55.一种修饰植物细胞中的靶核酸的方法，该方法包括：使靶核酸与以下接触：(a)CRISPR
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Cas核酸酶，其包含第一DNA结合结构域和第一DNA内切核酸酶(切口酶)；(b)逆转录酶；(c)CRISPR RNA(crRNA)，其包含与靶核酸上的第一位点具有基本同源性的间隔区；(d)反式激活crRNA(tracrRNA)，其与crRNA和CRISPR
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Cas核酸酶相互作用(例如，募集、结合等)；和(e)编码修复模板的核酸(例如，编码修复模板的RNA)，其包含引物结合位点和编码待并入靶核酸的修饰的模板，
其中tracrRNA包含与逆转录酶模板的5'端或3'端的序列互补的5'端或3'端的序列，从而修饰靶核酸。56.根据权利要求55所述的方法，其还包括使靶核酸与两种或更多种crRNA、两种或更多种tracrRN...
【专利技术属性】
技术研发人员：A，
申请(专利权)人：孟山都技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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