使用重编程tracrRNA的RNA检测和转录依赖性编辑制造技术

本申请涉及用于检测细胞、组织、和/或样本中至少一种已知RNA的方法，及其各自的系统、以及诊断和治疗用途，其中方法使用至少一种与该已知RNA特异杂交的非天然存在tracrRNA、以及至少一种与至少一种靶标核酸结合的tracrRNA依赖性CRISPR核酸酶。依赖性CRISPR核酸酶。依赖性CRISPR核酸酶。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】derived variants.Nat Rev Microbiol.2020；18(2)：67
‑
83)。crRNA
‑
tracrRNA双链体通过持家内切酶RNA酶III来切割，并被系统特异的单效应核酸酶所结合。之后核酸酶使用RNA双链体中的crRNA来引导DNA，以及在一些情况下，靶向RNA。迄今为止，已经报道有多个tracrRNA依赖性CRISPR核酸酶，包括Cas9、Cas12b1/C2c1、Cas12b2、Cas12e/CasX、Cas12f1/Cas14a、Cas12g、和Cas12k。Cas12k核酸酶是独特的，因为它们配合一套转座子基因而进行作用，进行RNA指导的DNA模板插入(RNA
‑
guided DNA insertion with CRISPR
‑
associated transposases.Science.2019；365(6448)：48
‑
53)。在各上述情况中，tracrRNA：crRNA双链体，当基因改造为称为单向导RNA(sgRNA)的单RNA嵌合体时，也指导Cas9和其他tracrRNA依赖性CRISPR核酸酶对dsDNA的序列特异性切割(参见Jinek，M.et al.A programmable du
‑
al
‑
RNA
‑
guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.Science 337，816
‑<br/>821(2012)；Engineering of CRISPR
‑
Cas12b for human genome editing.Nat Commun.2019；10(1)：212)。
[0004]新凶手弗朗西丝氏菌(Francisella novicida)的CRISPR
‑
Cas9系统表现出Cas9与其内源性DNA靶标的PAM依赖性相互作用，其依赖于非规范的小CRISPR相关RNA(scaRNA)和tracrRNA。自然地，scaRNA似乎会引导Cas9到具有部分互补性的基因组DNA靶标，引起转录抑制。scaRNA可以重编程成抑制其他基因，且随着基因改造的扩展的与外源性靶标的互补性，也可以引导DNA切割(Catalytically Active Cas9 Mediates Transcriptional Interference to Facilitate Bacterial Virulence Mol Cell.2019 Aug 8；75(3)：498
‑
510.e5)。鉴于scaRNA在CRISPR
‑
Cas系统中编码，类似于crRNA，之前已知的仅有的能够引导CRISPR核酸酶到达其意向靶标的RNA的源头，仅来自于CRISPR
‑
Cas系统内部。
[0005]在专利技术人最近的发表中(CRISPR RNA
‑
Dependent Binding and Cleavage of Endoge
‑
nous RNAs by the Campylobacter jejuni Cas9.Mol Cell.2018；69(5)：893
‑
905.e7)，他们对与空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)Cas9核酸酶(CjeCas9)共免疫沉淀的RNA进行了测序，揭示出一小组展现出与该菌CRISPR基因座中编码的crRNA向导部分有着互补性的RNA。专利技术人在另一空肠弯曲菌的菌株中进行了相似的共免疫沉淀实验。得到的未公开数据集包括一组没有展现出与crRNA互补性而与tracrRNA的抗
‑
重复序列的部分有互补性的RNA(图1)。这些RNA的组成和大小与crRNA相似。这些观察表明，成熟crRNA(引导Cas9到其靶标)可以衍生自信使RNA和其他RNA(例如，核糖体RNA、转运RNA、小RNA、反义RNA、核仁小RNA、微小RNA、piwiRNA、非编码长RNA、剪切的内含子、环状RNA)，包括由CRISPR阵列编码的那些。在本专利技术的背景下，这些RNA可以指定为、和/或称为非规范crRNA(ncrRNA)。
[0006]在CRISPR重复序列与抗
‑
重复序列的tracrRNA之间的碱基配对形成RNA双链体，其由tracrRNA依赖性CRISPR核酸酶结合。双链体的确切二级结构多样化，一些双链体展现出完美的互补性，而另一些包含特征性的凸起。不管确切的二级结构如何，保持该二级结构作为针对化脓性链球菌Cas9的sgRNA的一部分，使得可以对该sgRNA区域的序列进行改造(Guide RNA functional modules direct Cas9 activity and orthogonality.Mol Cell.2014；56(2)：333
‑
339)。因而，专利技术人假设，tracrRNA的抗
‑
重复序列部分的序列可以变化成与其他RNA互补，使得各RNA的这个部分变为成熟crRNA(图2)。
[0007]改变tracrRNA的抗
‑
重复序列的部分的概念仍待探讨，特别是用于将任何RNA转化为ncrRNA。在sgRNA的背景下，在抗
‑
重复序列部分的区域下游的区域可以进行改造，并且包
含一些变化而不破坏sgRNA的功能(Guide RNA functional modules direct Cas9 activity and orthogonality.Mol Cell.2014；56f2)：333
‑
339)。此外，Scott，T.等人(Improved Cas9 activity by specific modifications ofthe tracrRNA.Sci Rep.2019；9(1)：16104)示出在抗
‑
重复序列的区域之外的区域可以经改变而改善由Cas9RNP展现的总体编辑活性，尽管机制仍不清楚。然而，这些区域参与Cas9的识别，不参与与crRNA或任何其他RNA的配对。
[0008]WO2019/126037涉及组合物和方法，其使用具有基因改造的反向激活crRNA(tracrRNA)序列核酸序列、和/或具有向导RNA(gRNA)序列的核酸序列，其中tracrRNA序列的至少一个尿嘧啶核苷酸用非尿嘧啶的核苷酸替换，其中该gRNA序列的一个或多个胞嘧啶核苷酸和/或一个或多个尿嘧啶核苷酸为修饰的核苷酸。公开了一种组合物，还包含RNA
‑
引导的DNA核酸内切酶，例如Cas9或Cpfl，或II类CRISPR核酸内切酶或其变体，例如失活的Cas9(dCas9)或突变Cas9切口酶(D10A)。
[0009]US 2019/032053涉及包含向导RNA的组合物，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种非天然存在tracrRNA核酸分子，包含含有抗
‑
重复序列区域的序列的部分，该抗
‑
重复序列区域的序列设计成，经由形成模拟天然crRNA：tracrRNA双链体的复合体而与预选的已知RNA序列特异性杂交。2.一种复合体，包含权利要求1所述的非天然存在tracrRNA核酸分子、至少一种tracrRNA依赖性CRISPR核酸酶、和至少一种已知RNA。3.根据权利要求2所述的非天然存在tracrRNA核酸分子，还与靶标DNA核酸分子结合，该靶标DNA核酸分子包含基于至少一种已知RNA序列的序列、或包含基于至少一种已知RNA序列而设计的序列。4.一种用于检测细胞、组织、和/或样本中至少一种已知RNA的方法，该方法包括：a)使样本与至少一种非天然存在tracrRNA接触，该非天然存在tracrRNA包含与该已知RNA的第一部分特异性杂交的部分，其中该已知RNA的第二部分与至少一种靶标核酸特异性杂交，其中该至少一种非天然存在tracrRNA在至少一种tracrRNA依赖性CRISPR核酸酶的存在下，任选地还包括在至少一种RNA切割酶例如RNA酶III的存在下，与该已知RNA杂交、或者能够与该已知RNA杂交；b)检测该至少一种tracrRNA依赖性CRISPR核酸酶与该至少一种靶标核酸的结合；c)其中该结合测出该细胞、组织、和/或样本中的该至少一种已知RNA，且其中优选该核酸酶在其切割和/或切口活性方面失活。5.一种用于检测细胞和/或样本中至少一种已知RNA的方法，该方法包括：a)使样本与至少一种非天然存在tracrRNA接触，该非天然存在tracrRNA包含与该已知RNA的第一部分特异性杂交的部分，其中该已知RNA的第二部分与至少一种靶标核酸特异性杂交，其中该至少一种非天然存在tracrRNA在至少一种tracrRNA依赖性CRISPR核酸酶的存在下，任选地还包括在至少一种RNA切割酶例如RNA酶III的存在下，与该已知RNA杂交、或者能够与该已知RNA杂交；b)检测该核酸酶对该样本中该至少一种靶标核酸的切割；c)其中检测至少一种靶标核酸的切割，测出该细胞、组织、和/或样本中的该至少一种已知RNA。6.根据权利要求4或5所述的方法，其中检测该结合的、和/或切割的至少一种靶标核酸包括，检测合适标签例如染料、荧光团、或导电性的信号变化，和/或检测该切割的至少一种靶标核酸片段本身。7.一种用于检测细胞、组织和/或样本中至少一种已知RNA的方法，该方法包括：a)使样本与至少一种非天然存在tracrRNA接触，该非天然存在tracrRNA包含与该已知RNA的第一部分特异性杂交的部分，其中该已知RNA的第二部分与至少一种靶标核酸特异性杂交，其中该至少一种非天然存在tracrRNA在至少一种tracrRNA依赖性CRISPR核酸酶的存在下，任选地还包括在至少一种RNA切割酶例如RNA酶III的存在下，与该已知RNA杂交、或能够与该已知RNA杂交；以及b)使该样本中的该至少一种靶标核酸经该核酸酶切口或切割，c)可检测地编辑该至少一种靶标核酸，包括例如非同源末端连接(NHEJ)修复、微同源末端连接(MMEJ)、同源介导修复(HDR)、碱基编辑、引导编辑或RNA编辑，以及d)合适地检测该至少一种靶标核酸的编辑，包括例如选自检测得失位或基因编辑的存
在和/或长度、由该至少一种靶标核酸编码的基因或其他基因元件的激活/抑制、和/或检测该引导编辑或碱基编辑中的至少一种方法，e)其中检测该至少一种靶标核酸的编辑，测出该细胞、组织、和/或样本中的该至少一种已知RNA。8.一种用于记录细胞、组织和/或样本中至少一种靶标DNA的转录的方法，该方法包括：a)使该样本、细胞或组织与至少一种非天然存在tracrRNA接触，该非天然存在tracrRNA包含与已知RNA的第一部分特异性杂交的部分，其中该已知RNA的第二部分与至少一种靶标DNA特异性杂交，其中该至少一种非天然存在tracrRNA在至少一种tracrRNA依赖性CRISPR核酸酶的存在下，任选地还包括在至少一种RNA切割酶例如RNA酶III的存在下，与该已知RNA杂交、或能够与该已知RNA杂交；以及b)使该样本中的该至少一种靶标核酸经该核酸酶切口或切割，c)可检测地编辑该至少一种靶标DNA，包括例如非同源末端连接(NHEJ)修复、微同源末端连接(MMEJ)、同源介导修复(HDR)、可检测标记物、可检测修饰、碱基编辑、引导编辑或RNA编辑，以及d)任选地，合适地检测该至少一种靶标DNA的编辑，包括例如选自检测得失位(indel)或基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：查斯，
申请(专利权)人：尤利乌斯马克西米利安维尔茨堡大学，
类型：发明
国别省市：