绿盲蝽RNA降解酶、其编码基因、载体、菌株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了绿盲蝽RNA降解酶，所述绿盲蝽RNA降解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明专利技术还公开了编码所述的绿盲蝽RNA降解酶的核酸或基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明专利技术还公开了表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌株及其应用。本发明专利技术首次获得了绿盲蝽RNA降解酶的氨基酸及其基因序列，并构建其pFastBac1表达载体，并在大肠杆菌DH10Bac中转化鉴定获得重组杆状质粒转染SF9细胞获得P1~P3代病毒，纯化蛋白浓度为0.6mg/ml。纯化出的RNA降解酶蛋白可为此重组蛋白体外降解的功能验证提供前期准备，为后续探究其重组蛋白降解dsRNA的能力提供一定的实验支撑。dsRNA的能力提供一定的实验支撑。dsRNA的能力提供一定的实验支撑。

【技术实现步骤摘要】
绿盲蝽RNA降解酶、其编码基因、载体、菌株及其应用


[0001]本专利技术涉及农业科学及生物学
，具体涉及绿盲蝽RNA降解酶、其编码序列、载体、菌株及其重组蛋白和应用。

技术介绍

[0002]绿盲蝽Apolygus lucorum(Hemiptera：Miridae)属半翅目盲蝽科，分布范围广泛，为蔬菜、果树等多种经济作物上的重要害虫。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是由外源双链RNA(double
‑
strand RNA，dsRNA)引发内源互补信使RNA(messenger RNA，mRNA)沉默的过程。dsRNA介导的RNA干扰在半翅目、双翅目、鳞翅目等昆虫中应用成功，但是不同昆虫的RNAi效率差异很大，其中最重要的因素是昆虫体内存在一类RNA降解酶(dsRNase)，通过降解双链RNA从而降低RNAi的效率。
[0003]因此，研究绿盲蝽AldsRNase基因编码结构和其体外重组蛋白及重组蛋白纯化后降解的功能验证，探究其重组蛋白AldsRNase降解dsRNA的能力，可为提高RNAi效率提供一定的技术支撑。

技术实现思路

[0004]专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是提供了一种绿盲蝽RNA降解酶蛋白的制备方法。
[0005]技术方案：为了解决上述技术问题，本专利技术提供了绿盲蝽RNA降解酶，所述绿盲蝽RNA降解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0006]本专利技术的内容还包括编码述的绿盲蝽RNA降解酶的核酸或基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0007]本专利技术的内容还包括扩增所述的绿盲蝽RNA降解酶的核酸或基因的引物对，所述引物对序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
[0008]本专利技术的内容还包括表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌株，其包含所述的核酸或基因。
[0009]其中，所述重组载体为pFastbacI
‑
AldsRNase，其他能够用于该基因表达的载体也同样适用。
[0010]其中，所述重组菌株包括但不仅限于重组大肠杆菌。
[0011]本专利技术的内容还包括所述的核酸或基因、所述的表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌株在制备绿盲蝽RNA降解酶蛋白中的应用。
[0012]本专利技术的内容还包括绿盲蝽RNA降解酶蛋白的制备方法，包括以下步骤：
[0013]1)绿盲蝽RNA降解酶蛋白基因的获得：根据已知近缘物种基因序列设计PCR扩增引物，扩增所述的绿盲蝽RNA降解酶的基因；
[0014]2)绿盲蝽RNA降解酶蛋白重组杆状病毒表达载体的构建和鉴定；
[0015]3)绿盲蝽RNA降解酶蛋白重组杆状病毒的转染和收获；
000bp、2 000bp、3 000bp、4 000bp、5 000bp、6 000bp、8 000bp、10 000bp；
[0031]图4重组蛋白表达WesternBlot鉴定分析。泳道1：细胞裂解沉淀(阴性)；泳道2：细胞裂解上清(阴性)；泳道3：分泌培养基(阴性)；泳道4：细胞裂解沉淀(dsRNase)；泳道5：细胞裂解上清(dsRNase)；泳道6：分泌培养基(dsRNase)；泳道M：蛋白质分子质量标准；
[0032]图5分泌上清中纯化蛋白SDS
‑
PAGE分析电泳图。泳道1：细胞分泌上清样品；泳道2：流出；泳道3
‑
7：洗脱；泳道M：蛋白质分子质量标准；
[0033]图6蛋白纯化SDS
‑
PAGE电泳鉴定图。泳道1：BSA；泳道2：纯化蛋白AldsRNase；泳道M：蛋白质分子质量标准；
[0034]图7蛋白纯化Western Blot电泳鉴定图。泳道1：纯化蛋白AldsRNase；泳道M：蛋白质分子质量标准。
[0035]图8蛋白纯化AldsRNase的酶量(A)、pH条件(B)、反应时间(C)和温度条件(D)依赖性活性的曲线图和凝胶照片。A、B、C、D三幅凝胶图下方图是凝胶图中条带的光密度，是由GIS数码凝胶图像分析软件自动计算得到的。结果为均值
±
标准差。
具体实施方式
[0036]下面结合实施例对本专利技术作更进一步的说明和解释。所说明的实施例仅仅是本专利技术的一部分实施例，而并非全部的实施例。以上所述仅是本专利技术的优选实施方式，应当明确：此专利技术和实施例对于本
的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术原理的前提下，未做出创造性劳动成果，还可以做出若干改进和修饰，这些改进和修饰也属于本专利技术的保护范围。
[0037]下述实施例中所使用的实验步骤、仪器等，如无特殊说明，均为常规步骤和仪器。
[0038]下述实施例中所使用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0039]实施例1：AldsRNase基因的获得
[0040]采用TRIzol法提取绿盲蝽总RNA，选择合适的总RNA并进行纯化，使用Fermentas公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录合成第一链cDNA，PCR反应体系为：1μg总RNA，1μL 100μM oligo(dT)引物(5
’‑
TTTTTTTTTTTTTTTTTT
‑3’
)(SEQ ID NO.5)，加水至体积12μL，65℃处理5分钟，冰上静置1分钟。再依次加入4μL 5X reaction buffer、1μL RiboLock RNase Inhibitor(20U/μL)、2μL 10mM dNTP mix、1μL RevertAid M
‑
MuLV Reverse Transcriptase(200U/μL)，42℃孵育1个小时，70℃赋予5分钟得到cDNA。根据已知近缘物种基因序列设计适用于PCR扩增引物AldsRNase
‑
F(5
’‑
ATGTCGGTTCTGGCGCTCTG
‑3’
)(SEQ ID NO.1)及AldsRNase
‑
R(5
’‑
TTATTTCTTCTTGAATTGGAGGGTG
‑3’
)(SEQ ID NO.2)，获得绿盲蝽RNA降解酶基因保守序列，该保守序列参见序列表中的SEQ ID NO.3所示，PCR扩增体系为：15μL ddH2O，25μL 2
×
PCR Buffer for KOD FX Neo，1μL dNTP Mix(10mM)，5μL cDNA，1μL KOD FX Neo(1U/μL)，1.5μL AldsRNase
‑
F，1.5μL AldsRNase
‑
R；PCR扩增程序为：98℃预变性5min，98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸2min30s，循环35次，72℃延伸10min；将PCR本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.绿盲蝽RNA降解酶，其特征在于，所述绿盲蝽RNA降解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。2.编码权利要求1所述的绿盲蝽RNA降解酶的核酸或基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。3.扩增权利要求2所述的绿盲蝽RNA降解酶的核酸或基因的引物对，所述引物对序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。4.表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌株，其特征在于，其包含权利要求2所述的核酸或基因。5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pFastbacI
‑
AldsRNase。6.根据权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为重组大肠杆菌。7.权利要求2所述的核酸或基因、权利要求4所述的表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌株在制备绿盲蝽RNA降解酶蛋白中的应用。8.绿盲蝽RNA降解酶蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1）绿盲蝽RNA降解酶蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭永安，张杰钰，肖留斌，赵静，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：