用于构建GP130基因突变的胃癌模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用技术方案

本发明专利技术公开了用于构建GP130基因突变的胃癌模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用。该基因编辑系统，包含按照本发明专利技术所述方法制备的高效Cas9蛋白、经筛选的针对GP130基因的高效靶点gRNA以及含有GP130突变位点的单链Donor DNA，并对该系统各成分的最佳用量配比进行了优化，最终获得靶标位点点突变的单细胞克隆的比率为22.5％，远高于常规的点突变效率(<5％)。率(<5％)。率(<5％)。

【技术实现步骤摘要】
用于构建GP130基因突变的胃癌模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用


[0001]本专利技术属于基因编辑
，具体涉及CRISPR/Cas9系统及ssODN同源重组技术在构建GP130基因突变的胃癌模型猪核移植供体细胞中的应用。

技术介绍

[0002]胃癌(gastric cancer)是最常见的消化道恶性肿瘤。根据世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)发布的2020年全球最新癌症负担数据显示，胃癌占2020年内全球新增癌症病例的6.7％，位居第五，在国内则占比10.5％，位列第三，给我国人民造成了严重的健康威胁及经济负担，成为了当今最紧迫的健康问题之一。随着现代医疗的不断发展，尽管在癌症诊断、治疗和寿命方面有了进步，但对死亡率的改善程度一直不大。缺乏对疾病自然史的了解是造成这种局限性的主要原因，目前在分子水平上还不清楚胃癌中具体哪些变化可能导致肿瘤的化生、侵袭和转移。
[0003]白细胞介素6(interleukin6，IL
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6)是细胞因子网络中的重要成员，其家族包括IL
‑
6、IL
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11、IL
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27、IL
‑
31、抑瘤素M(OSM)、白血病抑制因子(LIF)、睫状神经营养因子(CNTF)、心肌营养素1(CT
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1)和心肌营养素样细胞因子1(CLCF1)，这些细胞因子在免疫、造血和神经系统中表现出多效的生物活性，同时在人体代谢、自身免疫细胞分化、疾病治疗等方面都有重要作用。GP130是IL
‑
6家族细胞因子功能受体复合物的常见信号转导成分，几乎表达于体内各种组织细胞上，其主要的作用之一就是利用胞外区结合IL
‑6‑
IL
‑
6R复合物，向细胞内传导信号，从而参与上述重要的生理过程。已有研究结果显示，在小鼠中GP130基因Y757F突变(对应猪GP130 Y779)可引起与人类胃癌疾病表型相似的症状，经比对该位置在不同物种间高度保守。这表明GP130突变会导致胃癌的发生，然而其致病机制尚不清楚。
[0004]研究由GP130突变导致胃癌或其他疾病发生发展的细胞和分子机制及研发相应的药物均需要在动物模型的基础上进行，目前常用的动物模型为小鼠模型，然而小鼠不论从体型、器官大小、生理、病理等方面都与人相差巨大，不能真实地模拟人类正常的生理、病理状态。而猪作为大动物，是人类长期以来主要的肉食供应动物，其体型大小和生理功能与人类近似，易于大规模繁殖饲养，而且在伦理道德及动物保护等方面要求较低，是理想的人类疾病模型动物。
[0005]基因编辑是近年来不断取得重大发展的一种生物技术，其包括从基于同源重组的基因编辑到基于核酸酶的ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等编辑技术，其中CRISPR/Cas9技术是当前最先进的基因编辑技术。目前，基因编辑技术被越来越多地应用到动物模型的制作上。
[0006]同源重组(HDR)是通过序列同源性交换DNA序列信息：即修复模板中包含所需插入片段，修复模板的两端则是与插入位点附近具有序列同源性的重组臂。过去通常使用双链DNA(dsDNA)作为修复模板，但最近的研究揭示了单链寡核苷酸脱氧核苷酸(ssODN)作为HDR供体模板的优越性。首先，ssODN作为供体模板比dsDNA模板的插入位点特异性高，dsDNA模板容易产生随机插入。其次，ssODN对同源重组臂的长度要求比dsDNA模板更短，单侧30～60
个碱基的重组臂设计可以获得高效且稳定的HDR，相比类似的dsDNA模板，其提供的插入效率更高。第三，dsDNA容易被NHEJ修复途径合并，从而导致同源臂的复制或者dsDNA模板的部分整合，而ssODN就不易产生这种现象。另外，dsDNAs对培养的细胞是有害的，线型或者质粒dsDNAs的转染效率较低，并使细胞产生不良反应，而ssODN模板在这些方面就更有优势。
[0007]因此，本专利技术采用CRISPR/Cas9技术联合ssODN同源重组技术进行了GP130基因的点突变基因编辑，模拟胃癌的自然发病遗传特征，并获得了GP130基因精确点突变的单细胞克隆，为后期通过体细胞核移植动物克隆技术培育胃癌疾病模型猪奠定了基础。该模型猪将为研究胃癌的发病机制及药物研发提供有力的实验工具。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是提供一种编码含Cas9蛋白的特异融合蛋白的特异融合基因。
[0009]本专利技术的又一目的是提供用于构建GP130基因突变的胃癌模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统。
[0010]本专利技术的又一目的是提供该基因编辑系统的应用。
[0011]含Cas9蛋白的特异融合蛋白；所述的特异融合蛋白自N端至C端依次包括如下元件：用于目的蛋白分泌表达的信号肽，增加目的蛋白可溶性表达的分子伴侣融合蛋白，用于蛋白纯化的标签蛋白，用于去除融合标签，从融合蛋白中获取天然形式Cas9蛋白的内切蛋白酶识别位点,引导Cas9蛋白进入细胞核的核定位信号1,Cas9蛋白(spCas9)，引导Cas9蛋白进入细胞核的核定位信号2。
[0012]所述特异融合蛋白中，用于目的蛋白分泌表达的信号肽选自大肠杆菌碱性磷酸酶(phoA)信号肽、金黄色葡萄球菌蛋白A信号肽、大肠杆菌外膜蛋白(ompa)信号肽或任何其他原核基因的信号肽，优选为碱性磷酸酶(phoA)信号肽。
[0013]所述特异融合蛋白中，增加目的蛋白可溶性表达的分子伴侣融合蛋白可为任何帮助形成二硫键的蛋白，优选为硫氧还原蛋白Trx，进一步优选为TrxA。
[0014]所述特异融合蛋白中，用于去除融合标签，从融合蛋白中获取天然形式Cas9蛋白的内切蛋白酶识别位点选自肠激酶(Enterokinase)、因子Xa(Factor Xa)，凝血酶(Thrombin)、TEV蛋白酶(TEV protease)、HRV 3C蛋白酶(HRV 3C protease)、WELQut蛋白酶或任何其他内切蛋白酶的识别位点，进一步优选为肠激酶识别位点。
[0015]所述特异融合蛋白中，便于目的蛋白纯化的蛋白标签选自His标签、GST标签、Flag标签、HA标签、c
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Myc标签或其他任何蛋白标签，进一步优选为His蛋白标签。
[0016]所述特异融合蛋白中，引导Cas9蛋白进入细胞核的核定位信号可为任何真核细胞核定位信号，进一步优选为SV40核定位信号和/或nucleoplasmin核定位信号。
[0017]所述特异融合蛋白中，cas蛋白选自Casl
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lO、Cpfl或其他类型Cas蛋白，优选为Cas9，进一步优选为spCas9。
[0018]所述特异融合蛋白自N端至C端依次包括如下元件：碱性磷酸酶(phoA)信号肽(phoA:SP)，硫氧还原蛋白A(TrxA)，His标签蛋白，肠激酶酶切位点(EK),核定位信号(SV40 NLS),Cas9蛋白(spCas9)，核定位信号(nucleop本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种含Cas蛋白的特异融合蛋白，其特征在于所述的特异融合蛋白自N端至C端依次包括如下元件：用于目的蛋白分泌表达的信号肽，增加目的蛋白可溶性的分子伴侣融合蛋白，用于蛋白纯化的标签蛋白，用于去除融合标签，从融合蛋白中获取天然形式Cas蛋白的内切蛋白酶识别位点,引导Cas蛋白进入细胞核的核定位信号,Cas蛋白，引导Cas蛋白进入细胞核的核定位信号。2.根据权利要求1所述的特异融合蛋白，其特征在于所述的用于目的蛋白分泌表达的信号肽选自大肠杆菌碱性磷酸酶信号肽、金黄色葡萄球菌蛋白A信号肽、大肠杆菌外膜蛋白信号肽或任何其他原核基因的信号肽，优选碱性磷酸酶信号肽；所述的增加目的蛋白可溶性表达的分子伴侣融合蛋白为任何帮助形成二硫键的蛋白，优选为硫氧还原蛋白Trx，进一步优选为TrxA；所述用于蛋白纯化的标签蛋白选自His标签、GST标签、Flag标签、HA标签、c
‑
Myc标签或其他任何蛋白标签，优选为His蛋白标签；所述用于去除融合标签，从融合蛋白中获取天然形式Cas蛋白的内切蛋白酶识别位点选自肠激酶、因子Xa，凝血酶、TEV蛋白酶、HRV 3C蛋白酶、WELQut蛋白酶或任何其他内切蛋白酶的识别位点，优选为肠激酶识别位点；所述引导Cas蛋白进入细胞核的核定位信号为任何真核细胞核定位信号，优选为SV40核定位信号和/或nucleoplasmin核定位信号；所述Cas蛋白选自Casl
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lO、Cpfl或其他类型Cas蛋白，优选为Cas9，进一步优选为spCas9；所述特异融合蛋白更进一步优选从N端至C端依次包括如下元件：碱性磷酸酶信号肽，硫氧还原蛋白，His标签蛋白，肠激酶酶切位点,核定位信号,Cas9蛋白，核定位信号。3.编码权利要求1或2所述的特异融合蛋白的特异融合基因；所述的特异融合基因序列优选如SEQ ID NO.1中第5209
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9849位核苷酸所示，或者如SEQ ID NO.2所示。4.一种原核Cas9高效表达载体pKG
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GE4，从上游至下游依次包括如下元件：启动子、操纵子、核糖体结合位点、权利要求3所述的特异融合基因、终止子；优选全序列如SEQ ID NO.1所示。5.权利要求3所述的特异融合基因、权利要求4所述的原核Cas9高效表达载体pKG
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GE4在制备Cas9蛋白中的应用。6.一种制备Cas9蛋白的方法，其特征在于包含以下步骤：(1)将鉴定正确的pKG
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GE4质粒转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，培养菌体，加入IPTG，在25℃的温度下诱导所述的基因工程菌表达可溶性目的蛋白，并收集菌体沉淀；(2)粗提融合蛋白，然后采用Ni
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NTA琼脂糖柱进行融合蛋白的纯...

【专利技术属性】
技术研发人员：牛冬，汪滔，马翔，陶裴裴，曾为俊，王磊，程锐，赵泽英，黄彩云，段星，刘璐，
申请(专利权)人：南京启真基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：