构建腺瘤性息肉病模型猪及结直肠癌模型猪的基因编辑系统及其应用技术方案

本发明专利技术公开了构建腺瘤性息肉病模型猪及结直肠癌模型猪的基因编辑系统及其应用。本发明专利技术提供了SEQ ID NO：18所示APC

【技术实现步骤摘要】
构建腺瘤性息肉病模型猪及结直肠癌模型猪的基因编辑系统及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体属于基因编辑
，更具体涉及基于APC基因突变构建腺瘤性息肉病模型猪及结直肠癌模型猪的基因编辑系统及其应用。

技术介绍

[0002]家族性腺瘤性息肉病(familial adenomatous polyposis，FAP)是一种常染色体显性遗传病，以结直肠内生长大量腺瘤性息肉为主要特征。所发生的息肉为癌前病变，十分容易发展为癌。FAP多发于青年，一般15
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25岁青春期开始出现临床症状，30岁左右最明显。FAP分为严重型、中间型、衰减型三种，其中严重型的癌变率为100％，衰减型为69％，中间型介于其间。FAP是由结肠腺瘤性息肉病(adenomatous polyposis coli，APC)基因突变造成的。人APC基因位于5q21
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q22，含8535个核苷酸，15个编码外显子，编码310kDa蛋白，含2843个氨基酸，75％编码序列位于外显子15，该外显子是胚系突变(指生殖细胞所携带的遗传性基因突变)和体系突变(指体细胞基因突变)最常发生部位。APC基因属抑癌基因，是Wnt信号转导通路中的信号分子，其通过降解β
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catenin负调节Wnt途径。APC突变导致β
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catenin增多，继而促进β
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catenin和TCF相互作用，上调下游靶基因(如细胞周期素D1和Myc)，驱动肿瘤形成。
[0003]APC基因突变方式众多，最常见的突变为基因序列的变化而导致终止密码子提前出现，产生无功能的截短蛋白。超过80％的FAP患者可检测到突变的APC基因，约20％患者的APC基因虽然没有发生突变，但其启动子受表观遗传修饰(如CpG岛的甲基化)而使其不能正常表达。APC单等位基因的功能缺陷足以导致FAP的发生。
[0004]结直肠癌(Colorectal Cancer,CRC)是一种最常见的恶性肿瘤。近年来，随着生活水平的提高，国内外结直肠癌的发病率保持着快速增长的态势，严重威胁着人类的健康。在2020年已超越胃癌，成为发病率第二高的癌症，而且近80％的患者一经发现就是中晚期，近半数患者生存期不到5年。前期研究数据表明，大多数结直肠癌起始于异常的腺窝，后逐渐演变成息肉，最终发展为结直肠癌。早期症状不明显，随着癌肿的增大而表现排便习惯改变、便血、腹泻、腹泻与便秘交替、局部腹痛等症状，晚期则表现贫血、体重减轻等全身症状。由中国8家大型三甲医院联合开展的大规模临床试验显示：结直肠癌有10年以上的窗口期，若早诊早治，生存率可超90％。
[0005]CRC的发生原因并不十分清楚，目前越来越多的证据表明与基因突变有关，其中APC基因突变及其导致的FAP被认为是CRC发生的主要驱动原因。APC单等位基因胚系突变可使该突变基因携带者发生FAP。APC双等位基因纯合胚系突变使胚胎致死。FAP进而使APC单等位基因突变携带者的另一个正常APC等位基因容易在息肉瘤体细胞中发生突变，导致息肉癌变，产生CRC。APC体细胞突变(APC体细胞突变是指其中的一条正常APC等位基因在体细胞水平发生了随机突变，另一个等位基因是遗传下来的不正常APC胚系突变，导致两个等位基因都出现了缺陷)见于80
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85％的散发CRC患者肿瘤组织中。APC基因位点杂合性缺失
(loss of heterozygosity,LOH)(APC位点杂合性缺失，是指其中的一个正常的APC等位基因片段部分或全部缺失，导致仅剩余了另一个不正常的APC等位基因)见于30％
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40％的CRC中。
[0006]现有研究表明APC基因突变常见于FAP和CRC中，在其他肿瘤中较少见，然而APC基因突变所导致疾病的致病机理及治疗方法还未明确，而这些均需要在动物模型的基础上进行。目前常用的动物模型为小鼠模型，然而小鼠不论从体型、器官大小、生理、病理等方面都与人相差巨大，不能真实地模拟人类正常的生理、病理状态。猪作为大动物，其体型大小和生理功能与人类近似，易于大规模繁殖饲养，同时在伦理道德及动物保护等方面的要求也较低，是理想的人类疾病模型动物。
[0007]基因编辑是近年来不断取得重大发展的一种生物技术，其包括从基于同源重组的基因编辑到基于核酸酶的ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等编辑技术，其中CRISPR/Cas9技术是当前最先进的基因编辑技术。目前，基因编辑技术被越来越多地应用到动物模型的制作上。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是提供基于APC基因突变构建腺瘤性息肉病模型猪及结直肠癌模型猪的基因编辑系统及其应用。
[0009]本专利技术提供了APC
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gRNA5、APC
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gRNA6和NCN蛋白在制备试剂盒中的应用。
[0010]本专利技术还提供了APC
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gRNA5、APC
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gRNA6和PRONCN蛋白在制备试剂盒中的应用。
[0011]本专利技术还提供了APC
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gRNA5、APC
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gRNA6和特异质粒在制备试剂盒中的应用。
[0012]本专利技术提供了一种试剂盒，包括APC
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gRNA5、APC
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gRNA6和NCN蛋白。
[0013]本专利技术还提供了一种试剂盒，包括APC
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gRNA5、APC
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gRNA6和PRONCN蛋白。
[0014]本专利技术还提供了一种试剂盒，包括APC
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gRNA5、APC
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gRNA6和特异质粒。
[0015]本专利技术提供了一种制备重组细胞的方法，包括如下步骤：将APC
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gRNA5、APC
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gRNA6和NCN蛋白共转染猪细胞，得到重组细胞。
[0016]所述共转染具体采用电击转染的方式。
[0017]电击转染的参数设置具体可为：1450V、10ms、3pulse。
[0018]所述共转染具体可采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪。
[0019]以上任一所述试剂盒还包括猪细胞。
[0020]以上任一所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)或(d)或(e)：(a)制备重组细胞；(b)制备腺瘤性息肉病模型猪；(c)制备腺瘤性息肉病细胞模型或腺瘤性息肉病组织模型或腺瘤性息肉病器官模型；(d)制备结直肠癌模型猪；(e)制备结直肠癌细胞模型或结直肠癌组织模型或结直肠癌器官模型。
[0021]APC
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gRNA5、APC
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gRNA6和NCN蛋白的配比依次为：0.8
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1.2μg APC
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gRNA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.APC
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gRNA5、APC
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gRNA6和NCN蛋白在制备试剂盒中的应用；所述APC
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gRNA5为sgRNA，其靶序列结合区如SEQ ID NO：18中第3
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22位核苷酸所示；所述APC
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gRNA6为sgRNA，其靶序列结合区如SEQ ID NO：19中第3
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22位核苷酸所示；所述NCN蛋白为Cas9蛋白或具有Cas9蛋白的融合蛋白；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)或(d)或(e)：(a)制备重组细胞；(b)制备腺瘤性息肉病模型猪；(c)制备腺瘤性息肉病细胞模型或腺瘤性息肉病组织模型或腺瘤性息肉病器官模型；(d)制备结直肠癌模型猪；(e)制备结直肠癌细胞模型或结直肠癌组织模型或结直肠癌器官模型。2.APC
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gRNA5、APC
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gRNA6和PRONCN蛋白在制备试剂盒中的应用；APC
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gRNA5为权利要求1中所述的APC
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gRNA5；APC
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gRNA6为权利要求1中所述的APC
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gRNA6；所述PRONCN蛋白自上游至下游依次包括如下元件：信号肽、分子伴侣蛋白、蛋白标签、蛋白酶酶切位点、核定位信号、Cas9蛋白、核定位信号；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)或(d)或(e)：(a)制备重组细胞；(b)制备腺瘤性息肉病模型猪；(c)制备腺瘤性息肉病细胞模型或腺瘤性息肉病组织模型或腺瘤性息肉病器官模型；(d)制备结直肠癌模型猪；(e)制备结直肠癌细胞模型或结直肠癌组织模型或结直肠癌器官模型。3.APC
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gRNA5、APC
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gRNA6和特异质粒在制备试剂盒中的应用；APC
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gRNA5为权利要求1中所述的APC
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gRNA5；APC
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gRNA6为权利要求1中所述的APC
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gRNA6；所述特异质粒自上游至下游依次包括如下元件：启动子、操纵子、核糖体结合位点、PRONCN蛋白的编码基因、终止子；所述PRONCN蛋白自上游至下游依次包括如下元件：信号肽、分子伴侣蛋白、蛋白标签、蛋白酶酶切位点、核定位信号、Cas9蛋白、核定位信号；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)或(d)或(e)：(a)制备重组细胞；(b)制备腺瘤性息肉病模型猪；(c)制备腺瘤性息肉病细胞模型或腺瘤性息肉病组织模型或腺瘤性息肉病器官模型；(d)制备结直肠癌模型猪；(e)制备结直肠癌细胞模型或结直肠癌组织模型或结直肠癌器官模型。4.一种试剂盒，包括APC
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gRNA5、APC
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gRNA6和NCN蛋白；APC
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gRNA5为权利要求1中所述的APC
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gRNA5；APC
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gRNA6为权利要求1中所述的APC
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gRNA6；NCN蛋白为权利要求1中所述的NCN蛋白；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)或(d)或(e)：(a)制备重组细胞；(b)制备腺瘤性息肉病模型猪；(c)制备腺瘤性息肉病细胞模型或腺瘤性息肉病组织模型或腺瘤性息肉病器官模型；(d)制备结直肠癌模型猪；(e)制备结直肠癌细胞模型或结直肠癌组织模型或结直肠癌器官模型。5.一种试剂盒，包括APC
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gRNA5、APC
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gRNA6和PRONCN蛋白；APC
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gRNA5为权利要求1中所述的APC
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gRNA5；APC
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gRNA6为权利要求1中所述的APC
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【专利技术属性】
技术研发人员：牛冬，汪滔，陶裴裴，曾为俊，王磊，程锐，赵泽英，马翔，刘璐，段星，黄彩云，
申请(专利权)人：南京启真基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：