多核苷酸组合物制造技术

本发明专利技术提供了用于稳定多核酸并增加多核酸通过细胞膜且在细胞内起作用的能力的组合物。一方面，本发明专利技术提供了一种多核苷酸与某些聚醚嵌段共聚物之间形成的多核苷酸复合物。优选地，多核苷酸复合物进一步包括一种聚阳离子聚合物。另一方面，本发明专利技术提供了一种多核苷酸与含有一种聚醚嵌段和一种聚阳离子嵌段的嵌段共聚物之间形成的多核苷酸复合物。另一方面，本发明专利技术提供了在５′或３′末端共价修饰以结合聚醚聚合物片段的多核苷酸。另一方面，本发明专利技术提供了某些优选的聚阳离子聚合物。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
多核苷酸组合物本申请是美国申请08/342,209(1994年11月18日提出申请，标题是“多核苷酸组合物”)的部分继续，该文献在此引入作为参考。本专利技术涉及多核酸聚合物的组合物，诸如RNA或DNA聚合物和通过共价键或非共价键与烷基醚的嵌段共聚物连接的聚阳离子。在一个优选的实施方案中，将多核酸与一种聚阳离子复合。通过复合使多核酸保持稳定，并且多核酸(在复合物中)增加了通过细胞膜的渗透性。因此，这种复合物非常适于用作将核酸输送入细胞的载体。利用“反义”多核酸治疗遗传疾病、细胞突变(包括引起或增加突变的癌症)和病毒感染已经得到了普遍关注。人们认为这种治疗手段通过以下方式起作用，一方面，通过结合编码一种蛋白质(人们认为它与导致试图治疗的疾病有关)的mRNA的“有义”链，从而终止或抑制mRNA翻译成不需要的蛋白质；另一方面(例如)，用反义多核苷酸靶向结合基因组DNA(形成三股螺旋)来抑制转录，见Helene，《抗癌药设计》，6：569(1991)。一旦已知所试图结合的mRNA的序列，那么根据Watson-Crick碱基配对原则，就可以将反义分子用于结合有义链，从而形成一种类似于双螺旋DNA的双螺旋结构(基因调节：《反义RNA和DNA生物学》，Erikson和Ixzant编，Raven出版社，纽约，1991；Helene，《抗癌药设计》，6：569(1991)；Crooke，《抗癌药设计》，6：609(1991))。充分利用这一技术的一个严重障碍是以下这个难题，即将足量的反义分子有效地引入细胞，从而有效地干扰靶向mRNA的翻译或DNA的功能。已经应用于克服这一难题的一种方法是用疏水取代基以共价键方式修饰反义多核酸分子的5′或3′末端。这些修饰的核酸一般可以高效率地进入细胞内部，见，例如，Kabanov等，FEBS Lett.，259：327(1990)；Boutorin等，FEBS Lett.，23：1382-1390，1989；Shea等，《核酸研究》，18：3777-3783，1990。此外，已将反义分子的磷酸主链进行修饰以去除负电荷(见，例如，Agris等，《生物化学》，25：6268(1986)；Cazenave和Helene，《反义核酸和蛋白-->质：原理和应用》，Mol和Van der krol编，47页后，MarcelDekker，纽约，1991)或将嘌呤或嘧啶碱基进行修饰(见，例如，《反义核酸和蛋白质：原理和应用》，，Mol和Van der krol编，47页后，Marcel Dekker，纽约，1991；Millingan等，《肿瘤疾病的基因治疗》，Huber和Laso编，228页后，纽约科学院，纽约，1994)。其它用来克服细胞穿透障碍的尝试包括将反义多核酸序列引入一种能够以低拷贝数插入细胞的表达载体中，但如果这种表达载体在细胞中可以指导细胞机制合成更多基本量的反义多核分子。见，例如，Farhood等.，Ann，纽约科学院，716：23(1994)。这种方法包括使用具有引入反义序列的一种表达位点的重组病毒，见，例如，Boris-Lawrie和Temin，Ann，纽约科学院，716：59(1994)。其它的方法是通过用聚阳离子中和反义分子或其它核酸分子上的负电荷来增加膜的渗透性，见，例如，Kabanov等，《苏联科学综述》，11卷第2部分，1992；Kabanov等，《生物共轭化学》4：448(1993)；Wu和Wu，《生物化学》27：887-892，1988；Behr等，《美国国家科学院学报》86：6982-6986，1989。当然，反义多核酸分子不是可用于更好地穿透细胞膜的唯一类型的多核酸分子。为了制备重组蛋白质表达系统，必须将指导表达的核酸转运通过膜并进入将产生所需蛋白质的真核或原核细胞中。对于基因疗法来说，医务工作者设法将一种DNA载体引入一种或多种细胞型的生物体中，所述的DNA载体能够指导细胞中缺少的蛋白质的合成并将它用于大量表达时的细胞或生物体。将引入DNA而导致细胞产生一种新蛋白质、核酶或大量蛋白质或核酶的方法称作“转染”法。(一般地参阅，《肿瘤疾病》，Huber和Lazo编，纽约科学院，纽约，1994；Feigner，《药物释放综述报告》，5：163(1990)；McLachlin等，《分子生物学的核酸研究进展》38：91(1990)；Karlsson，S.B1ood，78：2481(1991)；Einerhand和Valerio，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，177：217-235(1992)；Makdisi等，《肝脏疾病的研究进展》，10：1(1992)；Litzinger和Huang，《生物化学生物物理学进展》，1113：201(1992)；Morsy等，J.A.M.A.270：2338(1993)；Dorudi等，《英国外科杂志》，80：566(1993)。-->大量上述讨论的用反义多核酸增加细胞透入的方法一般是将各种多核酸引入细胞的可应用方法。其它的常规方法包括：多核酸的磷酸钙沉淀和用靶细胞培养法(Graham和Van der Eb，《病毒学》，52：456，1983)，多核酸、DEAE葡聚糖和细胞的共培养法(Sompayrac和Danna，《国家科学院学报》12：7575，1981)，在有多核酸的情况下细胞的电穿孔法(Potter等，《(国家科学院学报》，81：7161-7165，1984)，将核酸引入病毒包被以产生转染载体的方法(Giman等，《美国国家科学院学报》，82：7309-7313，1985)和用引入脂质体的多核酸培养细胞的方法(Wang和Huang，《美国科学院学报》，84：7851-7855，1987)。将多核酸送入细胞中的另一个难题是多核酸(特别是核糖核酸)对核酸酶活性的极端敏感性。这一难题特别与将核糖核酸用作反义寡核苷酸的尝试有关。因此，我们需要保护多核酸免受核酸酶活性干扰的方法。                    专利技术概述本专利技术参照由Hansch和Leo建立的片段常数进行如下描述(见Hansch和Leo，《化学和生物学中用于相关分析的取代基常数》，Wiley，纽约，pp320～325)。建立这些常数是用来估计分子的一部分在由辛醇-水混合物形成的相间出现分子分配倾向中的情况。一般将这些常数称作Hansch-Leo片段分配常数(下文称“Hansch-Leo片段常数”)。在第一实施方案中，本专利技术涉及一种多核苷酸组合物，它包括：(a)一种多核苷酸或衍生物；和(b)一种含有A型片段和B型片段的聚醚嵌段共聚物，其中A型片段含有一种相对亲水性的线性聚合片段，它的重复单元具有的平均Hansch-Leo片段常数是约小于或等于-0.4且具有的分子量在约30和约500之间，其中B型片段含有一种相对疏水性的线性聚合片段，它的重复单元具有的平均Hansch-Leo片段常数是约大于或等于-0.4且具有的分子量在约30和约500之间，其中至少约80％的键用来连接各个含有醚键的聚合片段的重复单元。在优选的第一实施方案中，聚醚嵌段共聚物选自以下通式的聚合物：A-B-A′，  A-B，-B-A-B′，或L(R1)(R2)(R3)(R本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多核苷酸组合物，其包含：（ａ）多核苷酸或多核苷酸衍生物；和（ｂ）高达约１５％（ｗ／ｖ）的聚醚嵌段共聚物，它包含含有线性聚合片段的Ａ型聚合片段和含有线性聚合片段的Ｂ型聚合片段，其中Ａ型聚合片段的重复单元具有的平均Ｈａｎｓｃｈ－Ｌｅ ｏ片段常数约小于或等于－０．４且具有的分子量在约３０和约５００之间，Ｂ型聚合片段具有的平均Ｈａｎｓｃｈ－Ｌｅｏ片段常数约大于或等于－０．４且具有的分子量在约３０和约５００之间，在上述聚醚嵌段共聚物中，至少约８０％连接各聚合片段的重复单元的键含有醚键。

【技术特征摘要】
US 1994-11-18 08/342,2091.一种多核苷酸组合物，其包含：(a)多核苷酸或多核苷酸衍生物；和(b)高达约15％(w/v)的聚醚嵌段共聚物，它包含含有线性聚合片段的A型聚合片段和含有线性聚合片段的B型聚合片段，其中A型聚合片段的重复单元具有的平均Hansch-Leo片段常数约小于或等于-0.4具有的分子量在约30和约500之间，B型聚合片段具有的平均Hansch-Leo片段常数约大于或等于-0.4且具有的分子量在约30和约500之间，在上述聚醚嵌段共聚物中，至少约80％连接各聚合片段的重复单元的键含有醚键。2.权利要求1的多核苷酸组合物，其中所述的嵌段共聚物选自嵌段共聚物    A-B-A′，A-B，-B-A-B′和L(R1)(R2)(R3)(R4)     (I)     (II)  (III)           (IV)和其混合物，其中A和A′是A型线性聚合片段，B和B′是B型线性聚合片段，且其中R1，R2，R3和R4是(1)通式(I)、(II)或(III)的嵌段共聚物或(2)氢，且L是一种连接基团，条件是R1、R2、R3或R4中不超过两个是氢。3.权利要求1的多核苷酸组合物，其中90％连接各聚合片段的重复单元的键含有醚键。4.权利要求1的多核苷酸组合物，其中各聚合片段的重复单元具有的分子量在约30和约100之间。5.权利要求4的多核苷酸组合物，其中90％连接各聚合片段的重复单元的键含有醚键。6.权利要求5的多核苷酸组合物，其中95％连接各聚合片段的重复单元的键含有醚键。7.权利要求6的多核苷酸组合物，其中所有含嵌段B或B′的重复单元具有的Hansch-Leo片段常数约大于或等于-30。8.权利要求7的多核苷酸组合物，其中所有含嵌段A或A′的重复单元具有的Hansch-Leo片段常数约小于或等于-0.4。9.权利要求1的多核苷酸组合物，其中各聚合片段的重复单元基本上由通式为-0-R5的重复单元组成，其中n是从0至约5的整数且R5是：(1)-(CH2)n-CH(R6)-，其中n是从0至约5的整数且R6是氢；具有3-8个碳原子的环烷基；具有1-6个碳原子的烷基；苯基；烷基苯基，其中烷基具有1-6个碳原子；羟基；羟烷基，其中烷基具有1-6个碳原子；具有1-6个碳原子的烷氧基；具有2-7个碳原子的烷基羰基；烷氧基羰基，其中烷氧基具有1-6个碳原子；烷氧基羰基烷基，其中烷氧基和烷基各自独立地具有1-6个碳原子；烷基羧基烷基，其中每个烷基具有1-6个碳原子；氨烷基，其中烷基具有1-6个碳原子；烷基胺或二烷基氨基，其中烷基各自独立地具有1-6个碳原子；单或二烷基氨基烷基，其中烷基各自独立地具有1-6个碳原子；氯；氯代烷基，其中烷基具有1-6个碳原子；氟；氟代烷基，其中烷基具有1-6个碳原子；氰基；氰烷基，其中烷基具有1-6个碳原子或羧基；(2)一种具有3-8个环碳原子的碳环基团，它可以包括：具有1-6个碳原子的烷基，具有1-6个碳原子的烷氧基，具有1-6个碳原子的烷基氨基，其中烷基各自独立地具有1-6个碳原子的二烷基氨基，氨基，磺酰基，羟基，羧基，氟或氯取代基；或(3)一种具有3-8个环原子的杂环基团，它可以包括杂环烷基或芳香杂环基，可以包括1-4个选自氧、氮、硫和其混合物的杂原子，还可以包括具有1-6个碳原子的烷基，具有1-6个碳原子的烷氧基，具有1-6个碳原子的烷基氨基，其中烷基各自独立地具有1-6个碳原子的二烷基氨基，氨基，磺酰基，羟基，羧基，氟或氯取代基。10.权利要求9的多核苷酸组合物，其中所有含嵌段B或B′的重复单元具有的Hansch-Leo片段常数约大于或等于-30。11.权利要求10的多核苷酸组合物，其中所有含嵌段A或A′的重复单元具有的Hansch-Leo片段常数约小于或等于-0.4。12.一种多核苷酸组合物，其包含：(a)多核苷酸或多核苷酸衍生物；和(b)具有聚醚片段和聚阳离子片段的共聚物，其中聚醚片段包括含有线性聚合片段的A型聚合片段，聚阳离子片段含有多个阳离子重复单元，所述A型聚合片段的重复单元具有的平均Hansch-Leo片段常数约小于或等于-0.4且具有的分子量在约30和约500之间，其中至少约80％连接聚醚片段的重复单元的键含有醚键。13.权利要求12的多核苷酸组合物，其中所述的共聚物含有以下通式的聚合物：    B-A-R，A-R，A-R-A′和R-A-R′，     (V)   (VI) (VII)   (VIII)其中A和A′是A型线性聚合片段，B和B′是线性聚合片段，它们的单体具有的平均Hansch-Leo片段常数约大于或等于-0.4且具有的分子量在约30和约500之间，其中对于各聚合片段来说，至少约80％的单体间的键含有醚键，且在上述通式中，...

【专利技术属性】
技术研发人员：AV卡巴诺夫，VY阿拉科夫，SV维诺格拉斗夫，
申请(专利权)人：休普拉特克药品有限公司，
类型：发明
国别省市：CA[加拿大]