一种核苷酸疫苗制造技术

本发明专利技术涉及一种疫苗，它包含核酸构建体诸如ＤＮＡ构建体，特别是包含编码操作上被连接至抗原性蛋白或者肽编码序列的恒定链的序列的核酸构建体。本疫苗刺激免疫应答，特别是以ＭＨＣ－Ｉ依赖型、而ＣＤ４↑［＋］Ｔ细胞独立型方式的免疫应答。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种技术和方法，藉此，当应用病毒的和基于DNA的疫 苗时，可获得更快、更宽泛和更强的免疫应答。
技术介绍
尽管在免疫学领域中已具备当前的知识尤其是关于疫苗的技术，但是 尚未获得适于抗多种病原体的疫苗。广泛传播的HIV (人免疫缺陷病毒)、 HTLV (人T细胞亲淋巴病毒)、结核病和HCV (丙型肝炎病毒)的大流 行病仍然是有效接种力所未及的，同时禽流感和其他出现的病原体威胁着 颠覆我们的卫生健康体系。同样地，世界范围恐怖主义的爆发已将潜在的 流行病扩大到包括外来的且致命的病原体诸如埃博拉病毒、拉沙病毒和马 尔堡病毒。疫苗可以是预防性的它们是在实际感染发生前就神皮施用，或是治疗 性的这样它们引起或促进对已在体内病原体的免疫应答。接种的两种方 法都需要建立稳固的免疫应答。由感染或接种激活的免疫应答依赖于几种 细胞类型的交互作用，该细胞类型诸如T、 B和抗原呈递细胞以及几种不 同的分子，主要是抗原、MHC分子、T和B细胞受体，等等。抗原是肽片段，由MHC分子在抗原呈递细胞表面上呈递。抗原可以 是外来的，即病原性来源，或者源自生物体本身，因而称作自身或自体抗 原。MHC分子是由特定染色体区域编码的多态性基因家族的代表，被称为"主要组织相容性复合体"，即MHC。存在两种类型的MHC分子，MHC I型(MHC-I)和MHC II型(MHC-II )。辅助性T细胞是由存在于抗原呈递细胞表面上的MHC II型(MHC-II) 分子所呈递的抗原而刺激。MHC-II分子是在内质网内合成的。在合成过 程中，它们以防止MHC-II分子被与自身或自体抗原 一起负载的方式与恒 定链(Ii)组合在一起。MHC-II分子经恒定链中的信号序列被转运至特定 细胞室(compartment)内的细胞表面。随着该室经处理它的内容物的成熟， 它从溶酶体进展到次级内体(在与内吞嚢泡融合后)再到MHC II类室 (MIIC)。内吞嚢泡包含外源抗原，即蛋白酶切割的细菌肽片段。这些片 段是经它们的降解而制备的，以便被负载到MHC-II分子。MHC-II分子是 由恒定链以两部分处理而释放的，恒定链首先被蛋白酶降解，在MHC-II 结合域内只留下被称作CLIP的肽，然后用HLA-DM分子除去CLIP。此 时，MHC-II分子是游离的，以便于结合外源抗原并且在MIIC嚢泡融合至 质膜后将这些呈递在细胞表面。这启动了体液的免疫应答，因为被呈递的 抗原刺激了辅助性T细胞的激活，反过来又以多种方式激活B细胞，它最 终分化为抗体分泌细胞。细胞免疫应答被启动，当T细胞毒性细胞的T细胞受体识别了在抗原 呈递细胞上^f皮结合至MHC I类分子的抗原时。MHC-I分子不与功能性类 似于恒定链(其与MHC-II締合)的分子締合。另外，MHC-I至抗原呈递 分子的加工不同于MHC-II分子的加工，区别之处在于MHC-I分子已在内 质网中与抗原一起被负载。由MHC-I分子呈递的抗原主要是蛋白质的蛋白 酶体切割的肽片段，它已由抗原呈递细胞自身合成。这些蛋白可以是在细 胞内拥有的DNA编码的异常蛋白，或者是衍生于病毒或已感染细胞并寄 生于它的蛋白质合成机器的其他病原体的蛋白。涉及MHC I类的蛋白酶解 系统存在于几乎所有的细胞中。两种类型T细胞的功能是明显不同的，如它们的名称所隐含的。细胞 毒性T细胞消除细胞内病原体和肿瘤，是通过直接的细胞溶解和通过分泌 细胞因子诸如Y-干扰素。主要的细胞毒性T细胞是CD8+T细胞，它还是抗 原特异性的。辅助性T细胞也可以溶解细胞，但是它们的主要功能是分泌细胞因子，该细胞因子提高了 B细胞(产生抗体的细胞)和其他T细胞的 活性，因此它们广泛地增强了对外源抗原的免疫应答，包括抗体介导的和细胞毒性T细胞介导的应答机制。CD4+T细胞是免疫应答中的主要辅助性 T细胞表型。传统的疫苗依靠于完整的生物体，即已被杀灭的病原性菌抹或者减弱 病原性的菌抹。 一方面，这些疫苗冒着引入它们被设计去预防的疾病的风 险，如果减毒不充分或者如果在疫苗制备过程中足够多的生物体经杀灭步 骤而存活下来。另一方面，这种疫苗已减少了传染性而且常常是免疫原性 不足的，其导致源自接种的保护不充分。最近，分子生物学技术已被用于开发新的疫苗，基于来自病原性生物 体的个体抗原性蛋白。概念上，使用抗原性肽而非完整生物体可避免病原 性，同时提供包含最大免疫原性抗原的疫苗。但是，已证明选择给定蛋白 或多肽的最佳抗原是困难的，此外，已发现，纯的肽或碳水化合物趋于是 弱的免疫原。遗传(DNA)疫苗是新的且有希望的候选者，用于预防性和治疗性两 种疫苗的研发。通过组合载体(即，棵DNA、病毒载体、减毒活病毒，等) 的效能、抗原的表达水平以及重组的抗原本身(即，高的或低的亲合性 MHC结合物，结构决定子的选择用于或多或少地限制T或B细胞库等) 来确定后来发生免疫应答的强度。通常这纟皮认为是正确的，即免疫记忆的 有效诱导需要或者得益于CD4+ (辅助性细胞)T细胞与CD8+ (细胞毒性 的)T细胞和B细胞的相互作用，它们介导了许多免疫记忆的作用。但是， 常规DNA疫苗的一种潜在缺点是它们在人体中的低免疫原性。这种低免 疫原性的 一种可能起因是细胞内所形成的抗原限制性进入用于抗原加工 和对辅助性T细力包呈递的MHC II途径。专利技术概述因此，本专利技术以提高应答动力学的方式解决了刺激免疫应答的问题， 同时扩展和改善了应答，此外，避免了现有技术中所述接种方法的上述缺点。尤其是，特此提供了一种用于直接的、特异性和快速刺激免疫系统的 新系统，以便改善所有动物的接种。这种问题是用本专利技术的实施方案解决的，它们的特征列于权利要求。 根据本专利技术，发现抗原融合至恒定链极大地加强了后来发生的抗病毒CD4+和CD8+T细胞应答。此外，令人惊奇地发现，这种作用是通过CD4+T细 胞独立性机理而获得的。进一步还发现，这种保护在急性局部化且致命性 感染中不仅被加速而且被加强，和在高剂量系统性感染中被加强。因此，本专利技术的一个目的是提供一种核酸构建体，其包含编码以下的 序列至少一个恒定链，该恒定链在操作上被连接至至少一个抗原性蛋白 或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段。一方面，本专利技术还提供了一种腺病毒载体，其包含编码以下的核苷酸 构建体刺激免疫应答的、至少一个抗原和至少一个蛋白或者肽或者蛋白 或肽的片段。因此， 一方面，本专利技术提供了用腺病毒载体刺激MHC-I介导的免疫应 答的手段，该载体包含编码至少一个抗原和至少一个蛋白或者肽或者蛋白 或肽的片段的核苷酸构建体。另一方面包括了用腺病毒载体刺激MHC-II应答，该载体包含编码至 少一个抗原和至少一个蛋白或者肽或者蛋白或肽的片段的核苷酸构建体。另一方面，本专利技术提供了刺激核酸构建体、腺病毒载体、任意这些或 任意这些的任意部分内所编码蛋白的细胞间传播的手段。本专利技术的另 一个目的是提供一种包含如这里所详述核酸构建体的传 输媒介物，特别是与本专利技术相关的一种传输媒介物，例如复制缺陷腺病毒 载体。本专利技术的另一个目的和方面是提供一种细胞，其包含根据本专利技术的核 酸构建体或腺病毒载体。本专利技术的另一个目的是提供一种嵌合蛋白，如这里所述核酸构建体所 编码的或者这里所述腺病毒载体所编码的。本专利技术的另本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核酸构建体，其包含编码以下的序列：ａ）至少一个恒定链，其在操作上被连接至　ｂ）至少一个抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：彼得约翰尼斯霍尔斯特，艾伦兰德鲁普汤姆森，简普瓦斯哥尔德克里斯滕森，
申请(专利权)人：哥本哈根大学，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]