增强蛋白和肽抗原免疫原性的Fc融合蛋白制造技术

本发明专利技术公开了在哺乳动物中增强预选蛋白或肽抗原免疫原性的组合物和方法。通过将预选抗原与免疫球蛋白重链恒定区相融合制备Ｆｃ－抗原融合蛋白以增强免疫原性。Ｆｃ－抗原融合蛋白与抗原呈递细胞表面的Ｆｃ受体结合，由此将该抗原靶向哺乳动物中的抗原呈递细胞。另外，还公开了佐剂家族，例如Ｆｃ－佐剂融合蛋白，其与Ｆｃ－抗原融合蛋白结合使用以增强或调节针对预选抗原的特定免疫应答。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
增强蛋白和肽抗原免疫原性的Fc融合蛋白的制作方法本申请要求申请日为1999年7月21日，申请号为60/144,965的专利申请的优先权，该申请所公开的内容在此引用作为参考。 专利技术的
一般来说，本专利技术涉及在哺乳动物中增强预选蛋白或肽抗原的免疫原性的组合物和方法。更具体地说，本专利技术涉及编码包括免疫球蛋白重链恒定区和预选抗原的融合蛋白的核酸和氨基酸序列，与单独的预选抗原相比融合蛋白中的预选抗原能够在哺乳动物中诱导更强的免疫应答。
技术介绍
传统的疫苗研制着重于生产能够中和感染抗原的防御抗体。目前，用作疫苗的抗原典型地包括灭活或减毒的微生物(例如细菌或病毒)，它们的产物(例如毒素)或纯化抗原。随着现代分子生物学和基因克隆方法学的到来，使制备更纯，特异性更明显的疫苗成为可能。免疫系统分子水平上的知识使人们能分离和描述由感染抗原刺激的免疫应答。据认为对成功地产生免疫应答至关重要的两个免疫系统组分包括调节和细胞毒性T细胞的关键作用；和通过抗原呈递细胞(APC)向这些细胞呈递抗原的方式。参见实施例，W.E.Paul，编(1993)免疫学基础，Raven出版有限公司，纽约。典型地，从APC细胞外部接受的蛋白或多肽抗原(外源抗原)在APC细胞的胞吞囊或核内体中被降解。于是所得的肽片断与主要组织相容性复合体(MHC)II类蛋白形成复合物。所得的复合物移动到细胞表面并呈现于与该APC邻近的免疫细胞。肽片断与MHC分子形成的沟相匹配，并且该复合物可由表达对该复合物具有结合特异性的T细胞受体的T细胞所识别。肽结合的MHC II类分子与在本领域内称为CD4 T细胞的辅助性T细胞之间的相互作用可通过另一相互作用，即MHC II类分子自身与T细胞表面的CD4+受体之间的相互作用予以进一步稳定。这样在APC细胞内加工的外源抗原通过MHC II类分子呈递到细胞表面。当MHC II类复合物呈现于CD4+T细胞表面时，可导致CD4+辅助细胞分泌细胞因子，该细胞因子刺激B细胞产生针对该肽的抗体。参见Paul，supra. 用外源抗原接种疫苗典型地导致CD4细胞-介导的T细胞应答，这种应答一般导致抗体产生。细胞毒性T细胞(CTL)典型地不由这种途径所刺激。显然地，CTL是由下述情况所刺激的，即其中的抗原源于APC自身内部(内源抗原)，例如在病毒感染细胞中产生的病毒蛋白或在癌细胞中产生的癌症特异性蛋白。事实上在许多病毒性疾病中，认为CTL细胞的产生是去除病毒感染细胞的关键，由此使感染得以恢复。研究表明内源抗原和外源抗原是经过不同加工的。在新生多肽形成过程中，部分多肽由一种称为proteosome的细胞内部结构降解。通过这一加工得到的片断与新合成的MHC I类分子而非MHC II类分子形成复合物，所得的含MHCI类分子复合物的抗原转运到细胞表面。再一次，对特异肽片段具有特异性的T细胞与T细胞结合，但在此种情况下，所需的共同受体相互作用出现在MHC I类分子和CD8分子之间。由此APC细胞表面的内源抗体呈现于CD8+T细胞。尽管有一部分CD8+T细胞不是细胞毒性的，但CD8+T细胞构成CTL的主要部分。据此，显然对能诱导CTL应答的疫苗的设计，需要抗原分子(一般为蛋白)或是在细胞内产生或是运送到合适的细胞区室以进入MHC加工途径。一种策略是将编码所需蛋白或肽的基因掺入到病毒中，然后用该基因工程病毒作为疫苗(Lorenz等(1999)人类基因治疗(HUM.GENETHER.)10623-631)。另一种策略是将编码蛋白的DNA载体注射到细胞中，再将该细胞施与动物或病人使其从细胞内部表达，再通过MHCI类分子呈递到细胞表面。(Donnelly等(1997)免疫学年评(ANNU.REV.IMMUNOL.)15617)。已经公开了一种将DNA载体直接注入肌肉或皮肤的简单技术，由此诱导对几种抗原的CTL和/或抗体应答(Lai等(1988)免疫学CRIT.综述(CRIT.REV.IMMUNOL.)18449-84和美国专利5,589,466)。研究结果表明抗原由APC摄入并加工由此呈现于免疫系统(Lai等，见上)。将外源的肽或蛋白运送到MHC I类途径已通过使用化学佐剂，例如弗氏佐剂、角鲨烯与去污剂的混合物(Hilgers等(1999)疫苗17219-228)，及最近通过使用可被巨噬细胞吞噬并通过一种供选择的MHCI类途径诱导CTL应答的抗原包被小珠(De Bruijn等(1995)欧洲免疫学杂志(EUR.J.IMMUNOL.)251274-1285)获得了部分的成功。而且其它增强对抗原免疫应答的方法可包括将化学佐剂与重组免疫刺激细胞因子，例如IL-2，IL-12，GM-CSF等结合使用。例如一种方法是用抗半抗原抗体与IL-2融合作为将这一细胞因子与蛋白抗原相连接的途径，该蛋白抗原已与该半抗原发生过化学反应。(Harvill等(1996)免疫学杂志1573165)。另一种技术通过将免疫球蛋白可变区的一部分区域用肽抗原替换开发出“抗原化”抗体。一旦重组抗体通过与APC细胞表面的Fc受体之间的相互作用结合于APC，杂合分子的肽抗原即呈递于APC(Lanza等(1993)美国国家科学院汇编(PROC.NATL.ACAD.Sci.USA)9011683-11687)。这种方法的一种扩展是将编码“抗原化的”免疫球蛋白重链的质粒DNA进行脾脏注射，此后当提供免疫球蛋白轻链部分时，脾脏衍生的B细胞可分泌重组抗体。抗体呈递系统的免疫原性是现代疫苗开发中的主要技术障碍之一。接种疫苗的目的是引起强免疫应答。但由于宿主的免疫系统已演化为对抗细菌和病毒，因而当用细菌或病毒作为载体时，信息将与信息载体一起遭到破坏。而且对某一病毒载体，例如牛痘和腺病毒的强免疫应答限制了它们的应用，可以理解在用细菌毒素作为蛋白载体时也会出现类似的问题。同样应用可变区的抗体衍生的“蛋白载体”由其特有的性质不被免疫系统视为“自体”，因而具有潜在地致免疫性。可以预见这些载体分子的多种应用均可以诱导抗独特型应答，因此妨碍了它们的有效应用。据此，本专利技术的一个目的是提供一种疫苗，其可产生针对预选蛋白或肽抗原强且持久的免疫。专利技术简述本专利技术部分地基于下述发现，即可以通过将预选抗原与免疫球蛋白重链恒定区相融合在哺乳动物中增强预选肽或蛋白抗原的免疫原性。所得的融合蛋白(这里也指“Fc-抗原融合蛋白”或“抗原融合蛋白”)或编码融合蛋白的核酸序列以疫苗的形式施用于哺乳动物以引起针对预选抗原的免疫应答。而且发现所引起的针对预选抗原的免疫应答的强度和类型可以通过将特定的佐剂和Fc-融合蛋白或编码Fc-融合蛋白的核酸序列一起使用得以调节。据此本专利技术提供一种在哺乳动物中增强预选抗原的免疫原性的方法。一方面，该方法包括对哺乳动物施用足以引发免疫应答的量的Fc-抗原融合蛋白，该融合蛋白包括通过多肽键和预选抗原相连接的免疫球蛋白重链恒定区。另一方面，该方法包括对哺乳动物施用一种核酸序列，例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，该核酸序列编码包含融合于上述预选抗原的免疫球蛋白重链恒定区的Fc-抗原融合蛋白。在哺乳动物中与相当的(例如通过重量或分子数)单独预选抗原，即不与免疫球蛋白重链恒定区相融合的预选抗原相比，当该预选抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在哺乳动物中增强预选抗原免疫原性的方法，该方法包括：将一种包括通过多肽键连接到预选抗原上的免疫球蛋白重链恒定区的融合蛋白以肌内地，静脉内地，经皮地或皮下地方式施用于哺乳动物，由此引发针对预选抗原的免疫应答，与单独的预选抗原相比，融合 蛋白中的预选抗原在哺乳动物中引起更强的免疫应答。

【技术特征摘要】
US 1999-7-21 60/144,9651.一种在哺乳动物中增强预选抗原免疫原性的方法，该方法包括将一种包括通过多肽键连接到预选抗原上的免疫球蛋白重链恒定区的融合蛋白以肌内地，静脉内地，经皮地或皮下地方式施用于哺乳动物，由此引发针对预选抗原的免疫应答，与单独的预选抗原相比，融合蛋白中的预选抗原在哺乳动物中引起更强的免疫应答。2.如权利要求1的方法，进一步包括将融合蛋白与佐剂结合使用，相对于不加佐剂时针对所施用的融合蛋白中的预选抗原所引起的免疫应答而言，该佐剂的用量足以增强针对融合蛋白中的预选抗原的免疫应答。3.如权利要求2所述的方法，其中，融合蛋白和佐剂同时施用。4.如权利要求2所述方法，其中，所述佐剂包括一种融合蛋白，该融合蛋白包含通过多肽键与佐剂蛋白相连接的免疫球蛋白重链恒定区。5.权利要求1或4的方法，其中免疫球蛋白重链恒定区包括免疫球蛋白铰链区。6.权利要求5的方法，其中的免疫球蛋白重链恒定区包含选自以下的免疫球蛋白重链恒定区结构域CH2结构域，CH3结构域，和CH4结构域。7.如权利要求5的方法，其中的免疫球蛋白重链恒定区包括CH2结构域和CH3结构域。8.权利要求1或4的方法，其中免疫球蛋白重链恒定区由氨基酸序列定义，该氨基酸序列对应于定义存在于同种哺乳动物中的免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸序列。9.如权利要求8所述的方法，其中定义免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸序列对应于人免疫球蛋白重链恒定区。10.如权利要求1所述的方法，其中的预选抗原选自前列腺特异的膜抗原，细胞因子受体胞外结构域，病毒蛋白和肿瘤特异性蛋白。11.如权利要求4的方法，其中的佐剂蛋白是细胞因子。12.如权利要求11的方法，其中的细胞因子由氨基酸序列定义，该氨基酸序列对应于定义存在于同种哺乳动物中的细胞因子的氨基酸序列。13.如权利要求12的方法，其中的细胞因子是人细胞因子。14.如权利要求1的方法，其中的哺乳动物是人。15.一种在哺乳动物中引发针对预选抗原的免疫应答的组合物，该组合物包含选自以下的以肌内地，静脉内地，经皮地或皮下的方式施用的混合物(a)一种与佐剂相混合的抗原融合蛋白，该蛋白包含通过多肽键连接到预选抗原上的免疫球蛋白重链恒定区；和(b)与佐剂融合蛋白相混合的预选抗原，该佐剂融合蛋白包含通过多肽键连接到佐剂蛋白上的免疫球蛋白重链恒定区。16.如权利要求15所述的组合物，其中(a)款中的佐剂包含一种融合蛋白，该融合蛋白包含通过多肽键连接到佐剂蛋白上的免疫球蛋白重链恒定区。17.如权利要求15所述的组合物，其中(b)款中的预选抗原通过多肽键与免疫球蛋白重链恒定区相连接。18.权利要求15，16或17所述的组合物，其中的免疫球蛋白重链恒定区包含免疫球蛋白铰链区。19.如权利要求18所述的组合物，其中的免疫球蛋白重链恒定区包含选自以下的免疫球蛋白重链恒定区结构域CH2结构域，CH3结构域，和CH4结构域。20.如权利要求18的组合物，其中的免疫球蛋白重链恒定区包括CH2结构域和CH3结构域。21.如权利要求15的组合物，其中(a)款中的佐剂包含CpG寡核苷酸序列。22.如权利要求15的组合物，其中的预选抗原选自前列腺特异的膜抗原，细胞因子受体的胞外结构域，病毒蛋白和肿瘤特异性蛋白。23.如权利要求15的组合物，其中(a)款中的抗原融合蛋白或(b)款中的佐剂融合蛋白通过二硫键与第二种免疫球蛋白重链恒定区相连接。24.如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：SD吉利斯，劳健明，JS小维索洛夫斯基，
申请(专利权)人：利思进药品公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]