一种免疫佐剂和含有该佐剂的疫苗制造技术

本发明专利技术提供了一种新型免疫佐剂，其主要成分是从卡介菌中提取的ＣｐＧ－ＤＮＡ，其为富含ＣｐＧ基序的ＤＮＡ。该佐剂为免疫刺激型佐剂，本身具有免疫活性作用，在体内诱导的是Ｔｈ１型免疫应答，可作为治疗与预防用疫苗佐剂。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及疫苗佐剂和含有该佐剂的疫苗，具体地是涉及来自卡介菌提取物的富含CpG基序的天然DNA，可用于治疗和预防用疫苗中的佐剂。
技术介绍
佐剂是疫苗中不可缺少的成分，在免疫佐剂方面，虽然铝佐剂的应用已接近80年，其安全性也经过了长期应用的检验，但由于其对细胞免疫作用不明显，尤其对细胞免疫为主的疫苗，如对高纯化的第二代重组疫苗和第三代DNA疫苗，效果甚微，因此人们一直致力于新型佐剂的研究。CpG-DNA刺激天然免疫，促进抗原特异的体液和细胞免疫，作为疫苗的佐剂已有实验室研究的记载。CpG-DNA疫苗佐剂活性主要体现在以下几个方面活化APC细胞，上调CD40、CD54、CD80、CD86和MHCII类分子等细胞分子的表达，增强抗原呈递能力；作为辅助刺激信号，协同TCR/BCR传入的抗原活化信号，活化抗原特异性的T细胞和B细胞；通过IFN-α/β、IL-12、IL-18等细胞因子诱生Th1类免疫应答；诱生较强的CTL反应。应答的抗体类型以IgG2a为主。但是目前的CpG-DNA研究都是针对人工合成的含CpG基序的寡核苷酸(ODN)，制备成本高，阻碍了临床应用的推广。细菌提取物是CpG-DNA的另一个来源，但是至今没有关于来自细菌的CpG-DNA作为佐剂的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种来源于细菌提取物的CpG-DNA免疫佐剂，该佐剂本身具有免疫活性，与疫苗中的抗原在体内作用能诱导Th1型为主的免疫应答。本专利技术同时提供该免疫佐剂作为治疗和预防用疫苗佐剂的用途和含有该佐剂的疫苗。本专利技术的CpG-DNA佐剂是来自提取物细菌，尤其是富含CpG基序的卡介菌提取物。本专利技术以该卡介菌DNA(BCG-CpG-DNA)做为疫苗佐剂，证实了其诱导的免疫反应特点，以此研制出新型的免疫佐剂。CpG-DNA是指含有未甲基化CpG二核苷酸基序的DNA，本专利技术得到的BCG-CpG-DNA是含有未甲基化CpG基序天然的CpG-DNA，它是从细菌中，优选是从卡介菌中提取的。本专利技术提供的BCG-CpG-DNA，一个重要的特点就是来自天然产物，其CpG含量可以通过高效液相检测而获得，即，其中的有效成分含量是已知的。其通过以下方法获得将菌种接种于适合分支杆菌生长的培养基中培养至对数期时收集菌体；菌体经破碎后离心收集上清液；上清液经CTAB(溴化十六烷基三甲基胺)的沉淀物用NaCl溶液溶解后用有机溶剂抽提收集无蛋白层，该无蛋白层再次抽提后的上清液用乙醇处理收集沉淀，对该沉淀进行后处理。得到的BCG-CpG-DNA中CpG的质量百分含量在15.75％-24.75％，优选是在21.5-23.5％，按照本专利技术具体提取方法得到的BCG-CpG-DNA中CpG的质量百分含量可以达到22.5％左右。检测CpG含量可以通过反相-高效液相法(RP-HPLC)采用特异甲基化酶SssI修饰CpG二核苷酸的胞嘧啶(dC)为5-甲基胞嘧啶(m5-dC)，利用核酸酶P1和细菌碱性磷酸酶(BAP)将DNA水解为单个脱氧核苷，利用反相-高效液相法(RP-HPLC)对修饰和未修饰的DNA水解样品中m5-dC检出量的差别而对CpG进行定量。根据本专利技术的另一个方面，就是通过大量试验探索证实，该新型富含CpG基序佐剂本身具有免疫活性，作为佐剂诱导的是Th1型为主的免疫反应，机体产生抗体类型以IgG2a为主，因此该富含CpG基序佐剂能赋予疫苗既能诱导体液免疫，也能诱导细胞免疫，在体内诱导Th1型为主的免疫反应的功能，从而发挥疫苗的预防作用及治疗作用。本专利技术更提供了一种含有BCG-CpG-DNA作为免疫佐剂的疫苗。该疫苗可以是BCG-CpG-DNA与抗原混合制备的液体疫苗，也可以是BCG-CpG-DNA与抗原混合后制备的冻干疫苗。即，本专利技术的这种疫苗可以是BCG-CpG-DNA佐剂与抗原混合而成，也可以是BCG-CpG-DNA与目前的铝佐剂疫苗混合而成。在本专利技术提供的疫苗中，该免疫佐剂BCG-CpG-DNA的含量为每单位剂量疫苗中10-250ug/人份，该用量与所用的抗原或疫苗有关。附图说明图1为BCG-CpG-DNA佐剂作用不同免疫时间的结果比较，图中1组--3μgHBsAg 2组--3μgHBsAg+50μgBCG-CpG-DNA3组--3μgHBsAg+100μgBCG-CpG-DNA 4组--1μgHBsAg+10μgBCG-CpG-DNA5组--3μgHBsAg-Al6组--3μgHBsAg-Al+50μgBCG-CpG-DNA7组--3μgHBsAg-Al+100μgBCG-CpG-DNA图2为BCG-CpG-DNA抗-HbsIgG亚类分析结果；图3为BCG-CpG-DNA对流脑多糖疫苗免疫结果的影响；图4为添加BCG-CpG-DNA的流脑多糖抗体IgG2a分析结果；图5为添加BCG-CpG-DNA的流脑多糖抗体IgG1分析结果。具体实施例方式以下通过具体实施例和试验结果详细介绍本专利技术的创新和应用意义所在，以帮助阅读者更好地理解本专利技术的精神和实质，但不构成对本专利技术实施范围的限定。一、BCG-CpG-DNA的制备步骤一，菌体培养将液体低温保藏的菌种(中国卡介苗制备用卡介菌株D2PB302，中国药品生物制品检定所菌苗室提供)室温下溶解，接种于马铃薯苏通培养基。37℃培养15天后转种于改良的液体苏通培养基，37℃下培养14-20天；其中， 马铃薯苏通培养基的制备方法可以是取洗净新鲜土豆(1个)，用穿刺器穿成圆柱，再用刀切成4公分长斜面；用流动饮用水冲洗土豆斜面1小时；用纯化水冲洗土豆斜面块；用苏通培养基冲洗斜面块；取苏通培养基20ml，加入100ml灭菌大管中；将冲洗后的土豆斜面放入装有苏通培养基的灭菌大管中；10磅20分钟灭菌。改良的液体苏通培养基配方及制备天冬素(AR) 4g柠檬酸(AR) 2gK2HPO4.3H2O(AR)0.5gMgSO47.H2O(AR) 0.5g柠檬酸铁铵(CP) 0.05g甘油(药用) 60ml蒸馏水 940ml以NH3.H2O调节pH7.2-7.4之间，然后加1％(W/V)硫酸锌1ml，10磅20分钟灭菌。步骤二、菌体收集待菌体生长至对数期时，对培养瓶逐瓶检查后，收集菌膜，加入适量去离子蒸馏水洗涤，压干后称重；步骤三、菌体破碎将收集的菌体以去离子蒸馏水按1g/ml混匀，以组织捣碎匀浆机(12000rpm/min)破碎菌体，3min×3次；步骤四、BCG-CpG-DNA的制备将破碎的菌体悬液以超纯水稀释到200mg/ml的浓度，高速冷冻离心机4℃、12000rpm/min离心，15min×2次，收集上清，在上清液中加入5MNaCl、5％(w/v)CTAB/0.3MNaCl，2000rpm/min、10min离心留沉淀，将沉淀溶于1M的NaCl溶液中，加入相同体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提至无蛋白层，氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，在收集的上清中加入2倍体积的无水乙醇，离心收集沉淀，再以70％乙醇洗涤3次，空气中风干后，溶解于TE缓冲液(Tris-Cl pH8.0)中，去离子水、TE缓冲液透析，0.45μm无菌滤器过滤，即为BCG-CpG-DNA佐剂，于-20℃保存。二、提取物中CpG有效成分的检测1、甲本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种免疫佐剂，其主要成分是从卡介菌中提取的ＣｐＧ－ＤＮＡ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王国治，赵爱华，贾淑珍，乔来艳，寇丽杰，
申请(专利权)人：中国药品生物制品检定所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]