本发明专利技术涉及一种抗呕吐毒素ＤＯＮ单链抗体ＳｃＦｖ及其制备与应用，属于生物制品领域。本发明专利技术从能够分泌抗呕吐毒素ＤＯＮ的单克隆抗体的杂交瘤细胞株ＭｃＧｉｌｌ０７８中，通过ＰＣＲ方法克隆获得该抗体重链和轻链的可变区基因Ｆａｂ段，通过基因工程的方法将两个基因重组后，构建原核表达质粒载体，转化大肠杆菌表达出能够特异性识别呕吐毒素ＤＯＮ的ＳｃＦｖ抗体活性片段，然后对重组单链抗体ＳｃＦｖ进行纯化和复性；本发明专利技术用作呕吐毒素ＤＯＮ抗体的重组单链抗体ＳｃＦｖ具有与呕吐毒素ＤＯＮ结合的活性。其优点是：对呕吐毒素ＤＯＮ的识别与结合活性，使其可用于呕吐毒素ＤＯＮ的残留检测，具有人源化改造后治疗呕吐毒素ＤＯＮ中毒的抗体药物前景，所构建的转化载体质粒易于保存与大量生产。
【技术实现步骤摘要】
：本专利技术涉及一种抗呕吐毒素DON单链抗体ScFv及其制备方法，由所述基因编码的多肽，含有所述基因的载体及所述基因和多肽的制备方法，属生物制品领域。
技术介绍
：脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)又名呕吐毒素，主要是由镰刀菌产生的次级代谢产物之一的单端孢霉烯族毒素，主要产毒菌是禾谷镰刀菌、雪腐镰刀菌等。目前被认为是存在于赤霉病小麦中的主要天然毒素之一。它可引起人畜中毒，因其广泛的存在并大量污染粮食，对人畜构成很大危害。联合国粮农组织和世界卫生组织1973年联合召开的第三次食品添加剂和污染物会议上，单端孢霉烯族毒素被定为最危险的自然发生食品污染物，列入国际研究的优先地位。DON化学性能稳定，具有较强的热抵抗力和耐酸，具有广泛的毒性，特别是对免疫功能具有明显的影响，根据DON的剂量和暴露时间不同可引起免疫抑制或免疫刺激。DON是全世界饲料和粮食的污染霉菌毒素之一，也是我国恶性肿瘤高发区居民粮食主要污染霉菌毒素之一，在我国北方食管癌高发区日常主食中高水平的普遍存在，而且这些毒素可能在食管癌形成中具有一定作用。我国在对江苏、安微、河南、甘肃、江西、贵州、上海赤霉病毒流行区小麦作DON、玉米赤霉烯酮的调查发现安徽小麦中DON含量最高达4,000g/kg，平均含量340g/kg；甘肃小麦受DON污染最严重，平均污染量达2,050g/kg，最高含量达20,000g/kg。小麦中玉米赤霉烯酮的污染，江苏最高约51g/kg、安徽为32g/kg、河南为8g/kg、甘肃为15g/kg、江西为6g/kg、上海为11g/kg。我国安徽，甘肃等地谷物中DON污染量严重超标。DON的污染常出现于小麦和玉米中，因此绝大部分DON检测方法是针对这些物质。DON的分离检测可用多种不同的方法，如薄层色谱法、酶联免疫吸附试验、气相色谱、高效液相色谱、超临界流体色谱法和毛细管电泳色谱等。各有其优点与不足：如TLC法的精确度低，操作过程复杂，分析结果的可重复性和再现性差；仪器方法具有灵敏、高选择性、准确性和精确性等优点但样品前处理复杂耗时；酶联免疫法优点是快速、灵敏、高通量，但抗体价格影响较大，抗体制备时间长，作为一种较为准确的快速筛查方法，抗体的制备的分子生物学研究已成为国内外研究热点。目前尚无有效药物治疗霉菌毒素中毒，抗菌素的解毒效果并不明显，而且会造成药物的残留与抗性等毒副作用。免疫治疗方法，因抗体的种间异源性及分子量过大造成宿主的防御性反应，而单链抗体ScFv则可以避免上述治疗难题；ScFv是具有完全抗体结合位点的最小抗体片段，大小为完整抗体的1/6，具有以下优点：(1)保持了抗体的特异性，大大减少了免疫原性；(2)组织穿透力强，分子量小，易进入靶标实体的微循环，且体内清除也较快；(3)无Fc段，可作为导向载体，以酶或细胞因子及药物连接构建双功能抗体，利于治疗与诊断；(4)易于基因操作和基因工程的大量生产；(5)可在多种不同的原核、真核表达系统中表达，如大肠杆菌、酵母、植物、昆虫、哺乳动物细胞等表达系统。-->目前关于呕吐毒素DON单链抗体ScFv的研究国内外未见报道，相关专利的申请国内外亦未见报道。
技术实现思路
：本专利技术针对以上现有技术存在的缺点，针对抗体杂交瘤细胞株在大规模生产上容易突变，细胞株不稳定，基因易丢失，代价昂贵等诸多缺点，本专利技术应用基因工程手段，提供了一种抗呕吐毒素DON的单克隆抗体重链和轻链可变区基因及所编码的多肽，重组后表达出特异性识别和结合呕吐毒素DON的抗体活性片段，使大规模廉价生产抗体成为可能。本专利技术的另一个目的在于：单链抗体ScFv片段在制备用于呕吐毒素DON残留检测试剂中的应用，为后续人源化改造及免疫治疗呕吐毒素DON中毒提供新的途径。本专利技术的目的是这样实现的：为了解决上述的技术问题，专利技术人从一株单克隆抗体的杂交瘤细胞株(定名为McGill078)，通过PCR方法克隆得到抗体的重链与轻链可变区基因，其主要的步骤为：从杂交瘤细胞株McGill078中用Trizol(Invitrogen)试剂提取总RNA，分离纯化mRNA(PolyATtract mRNA Isolation Systems，Promega)，按照Invitrogen试剂盒(SuperScript III First-Strand Synthesis Systen for RT-PCR)，以Oligo(dT)20为引物，RT-PCR逆转录合成cDNA，然后以设计特异性引物扩增VL和VH基因。其中，扩增VH的引物为：VHF：5’-ATGGCCCTCGAGGTGAAGCT-3’VHB：5’-TGAGGAGACGGTGACTGAGG-3’扩增VL的引物为：VKF：5’-GACATTGTGATGACACAGTC-3’VKB：5’-GCTCCAGCTT GGTCCCCCCT-3’序列测定后从NCBI中BLAST比较分析后，确认重链可变区基因序列为序列表中SEQID No.4所示的核苷酸序列，其编码的多肽序列为序列表中SEQ ID No.3所示的氨基酸序列；轻链可变区基因序列为SEQ ID No.6所示核苷酸序列，其编码的氨基酸序列为SEQ IDNo.5所示氨基酸序列。上述重链、轻链可变区基因经重组后，构建载体质粒转入大肠杆菌后可表达出特异性识别呕吐毒素DON的ScFv抗体可变区基因片段。对于本专利技术成功克隆的抗呕吐毒素DON的特异性单克隆抗体的重链、轻链可变区基因，经基因序列数据库(IMGT)和(NCBI)同源性比较，结果表明：所获得的基因序列来自小鼠胚系基因，其中重链、轻链可变区基因和现有报道的各种抗体基因序不完全一致，所获得的重链、轻链可变区基因均可以编码正确的小鼠抗体可变区氨基酸序列。本专利技术所涉及及所述的单克隆抗体重链和轻链可变区基因及其编码的多肽在检测呕吐毒素(DON)残留方面的应用。试验结果表明，ScFv抗体的抑制中浓度(I50)为5.3μg/mL，最低检测限I10为0.088μg/mL，线性检测范围在0.1～12.8μg/mL。以制备的单链抗体ScFv为模板，根据其核苷酸序列及氨基酸一级结构和三维空间构型进行改造(包括人源化)，具有成为免疫治疗呕吐毒素DON中毒的抗体药物前景。本专利技术的单克隆抗体重链和轻链可变区基因也可以采用基因工程方法，构建表达多种形式的小分子基因工程抗体，如嵌合抗体、ScFv抗体，抗体融合蛋白，导向药物载体等，并具制备用于呕吐毒素DON中毒的治疗抗体的药用前景。-->附图说明图1为PCR扩增的McGill078抗体重、轻链可变区基因的琼酯糖电泳图。图2为McGill078单链抗体ScFv基因的PCR产物电泳图；图3为载体pET26b(+)-ScFv结构示意图；图4为载体质粒pET26b(+)-ScFv转化大肠杆菌后的克隆基因测序图谱。图5间接竞争ELISA检测呕吐毒素标准抑制曲线。具体实施方式实施例一.抗呕吐毒素单克隆抗体McGill078杂交瘤细胞株的建立及抗抗呕吐毒素单克隆抗体的制备以文献方法(Casale WL，Journal of Agriculture and Food Chemistry，1988，36：663-668)合成抗原，按常规方法建立了该杂本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗呕吐霉素ＤＯＮ单链抗体ＳｃＦｖ，其特征在于其氨基酸序列为ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１所示。
【技术特征摘要】
1.一种抗呕吐霉素DON单链抗体ScFv，其特征在于其氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。2.一种抗呕吐霉素DON单链抗体ScFv的编码基因，其特征在于其编码基因序列为SEQ ID No.2所示。3.一种抗呕吐霉素DON单链抗体ScFv的重组载体，其特征在于，载体为pET26b(+)-ScFv，其含有SEQ ID No.2所示基因序列。4.一种抗呕吐毒素DON单链抗体ScFv的制备方法，其特征在于以下步骤实现：1)合成抗原；以蛋白BSA合成免疫用抗原，动物注射免疫Bab/C小鼠，以OVA合成包被用抗原；2)建立杂交瘤细胞株McGill078；获得免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，阳性克隆筛选后，获得杂交瘤细胞株McGill078，将杂交瘤细胞株McGill078进行培养、传代，重悬后接种于小鼠腹腔，10天后待腹部膨胀后采集腹水15ml；而后采用快速批次吸附法纯化鼠腹水中的抗呕吐毒素抗体，经测定单克隆抗体的浓度为9.2mg/ml，抗体类型为IgG1(γ1，κ)，具有抗原特异性和抗原亲和力；3)抗呕吐毒素DON单克隆抗体ScFv的重链、轻链可变区基因克隆取2×106个对数生长期的McGill078杂交瘤细胞，采用Trizol试剂提取总RNA，分离纯化mRNA；利用Invitrogen试剂盒，以Oligo(dT)20为引物，RT-PCR逆转录合成cDNA；通过PCR方法以特异性引物扩增轻链可变区基因、重链可变区基因；1％琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试验盒回收片段，T A克隆插入pMD18-T载体，获得抗呕吐毒素DON单克隆抗体ScFv的重链、轻链可变区基因；4)单链抗体ScFv的构建与表达ScFv的构建，采用重叠延伸法SOE用编码亲水性多肽接头(G4S)3将克隆的抗体轻、重链可变区基因连接，构成5’VH-Lingker-VL3’形式；ScFv与表达载体pET26b(+)经限制性内切酶BamHI、HindIII酶切后，T4连接酶连接，转化大肠杆菌TOP10F`中进行表达，进而针对以包涵体IBS形式表达ScFv表达系统，进行IPTG诱导表达；...
【专利技术属性】
技术研发人员：张存政，张晓，刘贤进，刘媛，祭芳，张强，王耘，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]
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