一种食品中呕吐毒素的检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种食品中呕吐毒素的检测试剂盒，包括：酶标抗原、酶标抗原稀释液、呕吐毒素单克隆抗体、呕吐毒素系列标准品溶液、化学发光底物A液、化学发光底物B液、浓缩复溶液、浓缩洗涤液。本发明专利技术试剂盒具有较高的灵敏度和特异性，对呕吐毒素的检测灵敏度可达到0.25mg/L。

Kit for detecting vomit toxin in food

The invention discloses a detection kit, a mycotoxin in food including enzyme labeled antigen, enzyme labeled antigen dilution, vomitoxin monoclonal antibody, vomitoxin series standard solution, chemiluminescence substrate liquid, A B chemiluminescent substrate solution and concentrated complex solution, concentrated washing liquid. The kit of the invention has high sensitivity and specificity, and the detection sensitivity of the emetic toxin can reach 0.25mg/L.

【技术实现步骤摘要】
一种食品中呕吐毒素的检测试剂盒
本专利技术涉及食品检测
，具体是一种食品中呕吐毒素的检测试剂盒。
技术介绍
呕吐毒素最早于1970年在日本的一次赤霉病大麦中毒的病毒中发现，可引起动物拒食和呕吐现象。呕吐毒素作为一种常见的真菌毒素，在自然界中广泛存在，主要污染小麦、玉米等粮食作物及其制品。由于呕吐毒素较强的毒性，世界各国都高度重视对其的监控，并制定出严格的限量标准：美国食品药品管理局（FDA）规定在小麦成品中的限量为1000μg/kg，欧盟规定谷粉和玉米粉中限量为750μg/kg，我国在国家标准中规定谷物中呕吐毒素的限量为1000μg/kg。现有的呕吐毒素检测方法主要有理化方法、ELISA方法、胶体金层析法等。这些方法各有优缺点，无法满足现场快速检测的需求。理化方法前处理过程复杂、仪器化程度高、操作繁琐、效率低。ELISA方法经过多次洗脱过程，标记物酶易失活，底物见光易分解，环境干扰因素复杂等缺点，且已不能满足越来越低的限量标准。胶体金层析法可以满足现场快速的要求，但是只能定性检测无法得到定量结果。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有较高的灵敏度和特异性的食品中呕吐毒素的检测试剂盒。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种食品中呕吐毒素的检测试剂盒，包括：酶标抗原、酶标抗原稀释液、呕吐毒素单克隆抗体、呕吐毒素系列标准品溶液、化学发光底物A液、化学发光底物B液、浓缩复溶液、浓缩洗涤液。作为本专利技术进一步的方案：所述的酶标抗原是辣根过氧化物酶标记的呕吐毒素半抗原的标记物，所述的呕吐毒素半抗原是由呕吐毒素与乙二胺在甲醇溶液中反应而得。作为本专利技术进一步的方案：所述的酶标抗原是辣根过氧化物酶标记的呕吐毒素半抗原的标记物，其保存于含0.048～0.052wt.%的吐温-20、0.034～0.038mol/L的pH值7.2～7.4的磷酸盐缓冲液中。作为本专利技术进一步的方案：所述的酶标抗原稀释液是pH值7.2～7.4、Na2HPO4浓度为0.012mol/L、NaCl浓度为0.23mol/L的缓冲溶液。作为本专利技术进一步的方案：所述的呕吐毒素单克隆抗体是由呕吐毒素半抗原与牛血清白蛋白得到的偶联物作为免疫原免疫Balb/c小鼠制备获得。作为本专利技术进一步的方案：所述的呕吐毒素单克隆抗体通过呕吐毒素半抗原与牛血清白蛋白得到的偶联物作为免疫原免疫Balb/小鼠、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选、亚克隆和小鼠腹水的效价测定得到。作为本专利技术进一步的方案：所述的化学发光底物A液为含有鲁米诺、对甲苯酚的三羟甲基氨基甲烷溶液，所述的化学发光底物B液为含有柠檬酸三钠和CO(NH2)2·H2O2的水溶液。作为本专利技术进一步的方案：所述的化学发光底物A液为鲁米诺含量为0.04～0.045μg/L、对甲苯酚含量为0.02～0.0025μg/L、pH值8.4～8.5的三羟甲基氨基甲烷溶液，所述的化学发光底物B液为每100ml水溶液含柠檬酸三钠3.1～3.5g和体积百分含量为0.65%的CO(NH2)2·H2O21.0～1.2ml。作为本专利技术进一步的方案：所述的呕吐毒素标准品溶液浓度分别为：0mg/L、0.25mg/L、0.50mg/、0.75mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、4.0mg/L、8.0mg/L，标准品稀释液为含0.03wt.%吐温-20、pH值7.2、0.05mol/L的磷酸盐缓冲液。作为本专利技术进一步的方案：所述的浓缩复溶液为10倍浓缩复溶液，具体是每升含100～120g的NaH2PO4·2H2O的水溶液。作为本专利技术进一步的方案：所述的浓缩洗涤液为10倍浓缩洗涤液，具体是含有体积分数0.5～0.6wt.%吐温-20、pH值7.4～7.5、1.2～1.6mol/L磷酸盐缓冲液。利用所述的食品中呕吐毒素的检测试剂盒进行检测的方法，包括下列步骤：（1）将酶标抗原与酶标抗原稀释液按照1：20的体积比进行稀释，得到酶标抗原工作液；（2）分别取50～55μL酶标抗原、50～55μL样品提取液和50～55μL呕吐毒素单克隆抗体，依次加入到容器中，在室温下反应22min，弃上清液后，用洗涤液300～500μL对复合物沉淀清洗3～5次；（3）往分离好的复合物中加入化学发光底物A液和化学发光底物B液各35μL，检测发出的相对光强度（RLU），样品中呕吐毒素的含量与RLU成负相关关系，可以通过RLU标准曲线计算呕吐毒素的残留浓度。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术试剂盒具有较高的灵敏度和特异性，对呕吐毒素的检测灵敏度可达到0.25mg/L。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1：试剂盒具体组分的制备1、呕吐毒素半抗原合成1.0g呕吐毒素与0.08g乙二胺在100ml甲醇中的混合液，在室温下反应5～6h，蒸除溶剂，定量得到呕吐毒素半抗原。2、酶标抗原的制备取10～15mg呕吐毒素半抗原，溶解于1～1.5mlN,N-二甲基甲酰胺（DMF）中；取27～32mg二氯乙烷（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）用0.1～0.3ml水充分溶解后于加入半抗原溶解液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A；称取辣根过氧化物酶（HRP）30～50mg，使之充分溶解在pH值7.2、3.8ml的磷酸盐缓冲液中，将反应液A逐滴缓慢滴加到HRP溶液中，并于室温下搅拌24h；用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液于4℃透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质，得到呕吐毒素酶标抗原；分装，于-20℃保存备用。3、免疫原的制备将HRP30～50mg替换为牛血清白蛋白（BSA）40～60mg，制备方法同上，得到免疫原。4、呕吐毒素单克隆抗体的制备A）动物免疫：用上述制备出的免疫原（RAC-BSA）按100μg/只，以生理盐水溶解免疫原与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈背部皮下注射免疫6～8周龄Balb/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28天以免疫原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，各追加免疫一次，融合前3天以免疫复合物100μg/只，不加弗氏佐剂再追加免疫一次。B）细胞融合：按常规方法进行，取免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）混合，然后在45秒内缓慢加入预热的融合剂（聚乙二醇2000）进行融合，用HAT培养基悬浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培养于96孔培养板，于37℃，5%CO2培养箱中培养，5天后用HT培养基半换液，9天时进行全换液。C）杂交瘤细胞的筛选：细胞融合后，待细胞长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。初选采用间接ELISA方法，以包被抗原（预先用方阵法常规滴定其最佳包被浓度和阳性血清稀释度）包被酶标板，加入被测孔培养上清，孵育，清洗后加入呕吐毒素标准品溶液35μL，再加入细胞上清液35μL和羊抗鼠IgG-HRP35μL，于37℃反应30min，洗板，再加入底物液显色液100μL，于25℃下避光反应15min，再加入终止液35μL，测定OD450nm值下降到对照孔的50%以下，判为阳性，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种食品中呕吐毒素的检测试剂盒，其特征在于，包括：酶标抗原、酶标抗原稀释液、呕吐毒素单克隆抗体、呕吐毒素系列标准品溶液、化学发光底物A液、化学发光底物B液、浓缩复溶液、浓缩洗涤液。

【技术特征摘要】
1.一种食品中呕吐毒素的检测试剂盒，其特征在于，包括：酶标抗原、酶标抗原稀释液、呕吐毒素单克隆抗体、呕吐毒素系列标准品溶液、化学发光底物A液、化学发光底物B液、浓缩复溶液、浓缩洗涤液。2.根据权利要求1所述的食品中呕吐毒素的检测试剂盒，其特征在于，所述的酶标抗原是辣根过氧化物酶标记的呕吐毒素半抗原的标记物，所述的呕吐毒素半抗原是由呕吐毒素与乙二胺在甲醇溶液中反应而得。3.根据权利要求1所述的食品中呕吐毒素的检测试剂盒，其特征在于，所述的酶标抗原稀释液是pH值7.2～7.4、Na2HPO4浓度为0.012mol/L、NaCl浓度为0.23mol/L的缓冲溶液。4.根据权利要求1所述的食品中呕吐毒素的检测试剂盒，其特征在于，所述的呕吐毒素单克隆抗体是由呕吐毒素半抗原与牛血清白蛋白得到的偶联物作为免疫原免疫Balb/c小鼠制备获得。5.根据权利要求1所述的食品中呕吐毒素的检测试剂盒，其特征在于，所述的化学发光底物A液为含有鲁米诺、对甲苯酚的三羟甲基氨基甲烷溶液，所述的化学发光底物B液为含有柠檬酸三钠和CO(NH2)2·H2O2的水溶液。6.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：周朱晨，张根义，胡彬，张进，吴念绮，周合，
申请(专利权)人：百奥森江苏食品安全科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32