小分子肺癌抗体导向免疫毒素及其设备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种小分子肺癌抗体导向免疫毒素及其制备方法和用途。用经抗正常肺细胞抗血清包被的肺癌细胞免疫小鼠，取小鼠脾脏分离Ｂ细胞，与骨髓瘤细胞ＳＰ２０杂交，经筛选获得一株对各种肺癌均有良好特异性和敏感性的抗体分泌细胞株ＬＡ１。提取ＬＡ１细胞的总ＲＮＡ，逆转录成ｃＤＮＡ，用ＲＴ ＰＣＲ扩增抗体的重链和轻链可变区，再用多肽基因片段连接重链、轻链可变区和免疫毒素，将重组基因装入质粒ｐＧＥＸ－４Ｔ－２，用该质粒转化大肠杆菌Ｂ１２１（λＤＥ３），发酵培养该大肠杆菌，经裂解、分离、纯化、复性，获得高纯度抗体导向的免疫毒素。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种小分子肺癌抗体导向免疫毒素及其制备方法和用途。肺癌是一种常见的肿瘤，在世界范围内其发病率和死亡率均居各种肿瘤的首位，自40年代以来，肺癌的发病率逐年上升，90年代初我国的肺癌发病率位48.5/10万，目前我国的肺癌死亡率已上升为恶性肿瘤死亡率的第三位，研究表明中国人属肺癌易患人群。(2000.4.6《人民卫生报》)，在上海肺癌死亡率已上升为恶性肿瘤死亡率的第一位。肺癌的早期发现难，尤其是小细胞肺癌易于早期和广泛转移存活率低，5年以上生存率仅为13％。目前对肺癌的诊断方法有，细胞学检查、侵入性检查、X片、CT扫描、NMR、CT引导下的胸穿针吸等，各种方法都有不同的缺陷，X片、CT扫描、NMR等方法对早期诊断的效果不好，细胞学检查和侵入性检查对外周孤立性肺结节的诊断用处不大，CT引导下的胸穿针吸假阴性率高，易发生气胸。对肺癌的治疗目前也没有特别有效的方法。本专利技术的目的是建立一对各种肺癌均有良好特异性和敏感性的小分子抗体导向免疫毒素的制备方法及用途。为了达到上述目的，本专利技术采取下列措施小分子肺癌抗体导向免疫毒素，其基因和氨基酸序列为ATG GGC AAG GAA TCC CGG GCC AAG AAA TTC CAG CGG CAG CAT ATGGAC TCA GAC AGT TCC CCC AGC AGC AGC TCC ACC TAC TGT AAC CAAATG ATG AGG CGC CGG AAT ATG ACA CAG GGG CGG TGC AAA CCA GTGAAC ACC TTT GTG CAC GAG CCC CTG GTA GAT GTC CAG AAT GTC TGTTTC CAG GAA AAG GTC ACC TGC AAG AAC GGG CAG GGC AAC TGCTAC AAG AGC AAC TCC AGC ATG CAC ATC ACA GAC TGC CGC CTG ACAAAC GGC TCC AGG TAC CCC AAC TGT GCA TAC CGG ACC AGC CCG AACGAG AGA CAC ATC ATT GTG GCC TGT GAA GGG AGC CCA TAT GTG CCAGTC CAC TTT GAT GCT TCT GTG GAG GAC TCT ACC GCA AAG AAG CTCAAC GAC GCA CAG GCA CCT AAG TCA GAT CAG GTC CAA CTG CAGGAG TCA GGG GGG GGC TTA GTG AAG CCT GGA GGG TCC CTG AAACTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACT TTC AGT AGC TAT GCC ATGTCT TGG GTT CGC CAG GCT CCA GAG AAG AGG CTG GAG TGG GTCGCA TCC ATT AAT TAT GGT GGT GAC ACC TAC TAT CCA GAC AAT GTGAAG GGC CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAT AAT GCC GGG AAC ATC CTGTTC CTG CAA ATG AGC AGT CTG AGG TCT GAG GAC ACG GCC ATG TATTAC TGT GCA AGA GTT TCG TAC TAC GGT CGT ACC TAC ACA TAT GCTATG GAC TAC TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGTGGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCGGAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA GCA CTC ATG GCT GCA TCT CCAGGG GAG AAG GTC ACC ATC ACC TGC AGT GTC AGC TCA AGT ATA AGTTCC AGC AAC TTA CAC TGG TAC CAG CAG AAG TCA GAA ACC TCC CCCAAA CCC TGG ATC TAT GGC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA GTC CCTGTT CGC TTC AGT GGC AGT GGA TCT GGG ACC TCT TAT TCT CTC ACAATC AGC AAC ATG GAG GCT GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGT CAACAG TGG AGT AGT TAC CCC CTC ACG TTC GGC TCG GGG ACC AAG TTGGAG ATC AAA CGG小分子肺癌抗体导向免疫毒素的制备方法的步骤如下1)取新鲜肺小细胞癌和肺腺癌组织匀浆，用抗人正常肺组织抗血清复被后免疫小鼠，取被免疫小鼠脾细胞和同系的骨髓瘤细胞SP20杂交融合，得多株单克隆抗体，经筛选获得一株对各种亚型的肺癌均有良好特异性和敏感性的单克隆抗体LA1。2)在37℃，5％CO2条件下培养单克隆抗体细胞LA1，当培养至107/ml时，用Trizol反应液提取细胞的总RNA，用逆转录酶逆转录成cDNA，以重链3＇引物TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CAG，5＇引物AG GTCCAA CTG CAG GAG TCA GG和轻链5＇引物GAC ATT GAG CTC ACC CAGTCT CCA，3＇引物G TTT GAT CTC GGT CCC，为引物用PCR的方法进行基因扩增，将扩增的基因克隆到pBluescript并测序。3)用基因片段C TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCCTCA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGCGGA TCG GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT C和轻链3′引物修饰扩增轻链可变区，用各200ng的重链可变区基因和经修饰的轻链可变区基因进行SOE连接。所得基因用重链5＇引物和轻链3＇引物进行基因扩增。将扩增所得的基因命名为SLA1，将该基因克隆到pBluescript并测序。4)用RNA5＇引物ATA GGC GCC ATG GGC GAA TCC CGG GCC AAGAAA TTC CGG GCC AAG AAA TTC，RNA 3＇引物CCC TGA CTC CTG CAGTTG GAC CTG ATC TGA CTT AGG TGC CTG TGC GTC GTT GAG CTT CTTTGC GGT AGA GTC CTC CAC AGA AGC ATC，扩增人胰腺RNA酶基因，用各200ng的RNA酶基因和SLA1基因进行SOE连接，所得的免疫毒素基因用RNA5＇引物和轻链3＇引物进行扩增，将扩增的基因克隆到pBluescript并测序。5)基因组装到质粒pGEX-4T-2，用该质粒转化大肠杆菌B121(λDE3)，在37℃用含本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小分子肺癌抗体导向免疫毒素，其特征在于：其基因和氨基酸序列为：ＡＴＧ ＧＧＣ ＡＡＧ ＧＡＡ ＴＣＣ ＣＧＧ ＧＣＣ ＡＡＧ ＡＡＡ ＴＴＣ ＣＡＧ ＣＧＧ ＣＡＧ ＣＡＴ ＡＴＧＧＡＣ ＴＣＡ ＧＡＣ ＡＧＴ ＴＣＣ ＣＣＣ ＡＧＣ ＡＧＣ ＡＧＣ ＴＣＣ ＡＣＣ ＴＡＣ ＴＧＴ ＡＡＣ ＣＡＡＡＴＧ ＡＴＧ ＡＧＧ ＣＧＣ ＣＧＧ ＡＡＴ ＡＴＧ ＡＣＡ ＣＡＧ ＧＧＧ ＣＧＧ ＴＧＣ ＡＡＡ ＣＣＡ ＧＴＧＡＡＣ ＡＣＣ ＴＴＴ ＧＴＧ ＣＡＣ ＧＡ Ｇ ＣＣＣ ＣＴＧ ＧＴＡ ＧＡＴ ＧＴＣ ＣＡＧ ＡＡＴ ＧＴＣ ＴＧＴＴＴＣ ＣＡＧ ＧＡＡ ＡＡＧ ＧＴＣ ＡＣＣ ＴＧＣ ＡＡＧ ＡＡＣ ＧＧＧ ＣＡＧ ＧＧＣ ＡＡＣ ＴＧＣＴＡＣ ＡＡＧ ＡＧＣ ＡＡＣ ＴＣＣ ＡＧＣ ＡＴＧ ＣＡＣ ＡＴＣ ＡＣＡ ＧＡＣ ＴＧＣ ＣＧＣ ＣＴＧ ＡＣＡＡＡＣ ＧＧＣ ＴＣＣ ＡＧＧ ＴＡＣ ＣＣＣ ＡＡＣ ＴＧＴ ＧＣＡ ＴＡＣ ＣＧＧ ＡＣＣ ＡＧＣ ＣＣＧ ＡＡＣＧＡＧ ＡＧＡ ＣＡＣ ＡＴＣ ＡＴＴ ＧＴ Ｇ ＧＣＣ ＴＧＴ ＧＡＡ ＧＧＧ ＡＧＣ ＣＣＡ ＴＡＴ ＧＴＧ ＣＣＡＧＴＣ ＣＡＣ ＴＴＴ ＧＡＴ ＧＣＴ ＴＣＴ ＧＴＧ ＧＡＧ ＧＡＣ ＴＣＴ ＡＣＣ ＧＣＡ ＡＡＧ ＡＡＧ ＣＴＣＡＡＣ ＧＡＣ ＧＣＡ ＣＡＧ ＧＣＡ ＣＣＴ ＡＡＧ ＴＣＡ ＧＡＴ ＣＡＧ ＧＴＣ ＣＡＡ ＣＴＧ ＣＡＧＧＡＧ ＴＣＡ ＧＧＧ ＧＧＧ ＧＧＣ ＴＴＡ ＧＴＧ ＡＡＧ ＣＣＴ ＧＧＡ ＧＧＧ ＴＣＣ ＣＴＧ ＡＡＡＣＴＣ ＴＣＣ ＴＧＴ ＧＣＡ ＧＣＣ ＴＣＴ ＧＧ Ａ ＴＴＣ ＡＣＴ ＴＴＣ ＡＧＴ ＡＧＣ ＴＡＴ ＧＣＣ ＡＴＧＴＣＴ ＴＧＧ ＧＴＴ ＣＧＣ ＣＡＧ ＧＣＴ ＣＣＡ ＧＡＧ ＡＡＧ ＡＧＧ ＣＴＧ ＧＡＧ ＴＧＧ ＧＴＣＧＣＡ ＴＣＣ ＡＴＴ ＡＡＴ ＴＡＴ ＧＧＴ ＧＧＴ ＧＡＣ ＡＣＣ ＴＡＣ ＴＡＴ ＣＣＡ ＧＡＣ ＡＡＴ ＧＴＧＡＡＧ ＧＧＣ ＣＧＡ ＴＴＣ ＡＣＣ ＡＴＣ ＴＣＣ ＡＧＡ ＧＡＴ ＡＡＴ ＧＣＣ ＧＧＧ ＡＡＣ ＡＴＣ ＣＴＧＴＴＣ ＣＴＧ ＣＡＡ ＡＴＧ ＡＧＣ ＡＧＴ ＣＴ Ｇ ＡＧＧ ＴＣＴ ＧＡＧ ＧＡＣ ＡＣＧ ＧＣＣ ＡＴＧ ＴＡＴＴＡＣ ＴＧＴ ＧＣＡ ＡＧＡ ＧＴＴ ＴＣＧ ＴＡＣ ＴＡ...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：田建峰，
申请(专利权)人：田建峰，
类型：发明
国别省市：97[中国|宁波]