一种新的抗蛋白酶的酸性α－半乳糖苷酶ＡＧＡ３６及其基因和应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程领域，具体地，本发明专利技术提供了一种新的抗蛋白酶的酸性α－半乳糖苷酶ＡＧＡ３６及其基因和应用。所述α－半乳糖苷酶ＡＧＡ３６的氨基酸序列如ＳＥＱ？ＩＤ？ＮＯ．１所示，该酶具有适宜的作用ｐＨ值，较强的金属离子和表面活性剂抗性，较强的蛋白酶抗性和较好的水解各种底物的能力，可作为一种饲料或食品添加剂应用于饲料与食品行业。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程领域，具体地，本专利技术涉及一种新a -半乳糖苷酶八6八36及其基因、包含该基因的重组载体和应用。
技术介绍
a -半乳糖苷酶(a -galactosidase， EC3. 2. 1. 22)即蜜二糖酶，属于外切糖苷酶类，能够专一性催化糖链非还原末端a-半乳糖苷键的水解，它不仅能够水解含a-半乳糖苷键的寡糖，而且还能够催化含该键的多糖。棉子糖、水苏糖、毛蕊花糖是豆类植物中广泛存在的低聚寡糖，在a -半乳糖苷酶的作用下，这些寡糖可以被分解为D-半乳糖和其他相应的单糖和寡糖。 豆粕是非常优秀的植物性蛋白质饲料原料，一般在日粮中的用量为25 30%。但在豆粕中含有5 6%的单胃动物不能消化的a -半乳糖苷类的低聚寡糖，如棉子糖、水苏糖等，这些寡糖一方面会引起动物的肠胃胀气疾病，另一方面会增加食糜的粘度，从而降低了动物对营养物质的消化与吸收。而在豆科饲料中添加a-半乳糖苷酶能够增加饲料中低聚寡糖的消化，减少此类低聚寡糖的抗营养作用，减轻或消除单胃动物的消化紊乱，从而提高饲料中营养物质的利用率和代谢能(Ghazi S， et al. BritishPoultry Science. 44 (3):410-418)。 在制糖工业中，由于甜菜中棉子糖的存在，造成糖蜜粘度增加而阻碍蔗糖结晶析出，以致产生大量的废糖蜜，使糖产量降低。应用a-半乳糖苷酶处理废糖蜜能将阻碍蔗糖结晶的棉子糖清除，在分解一分子棉子糖的同时，还产生一分子的蔗糖，因而提高蔗糖的得率(Ganter C. ， et al. Journal of Biotechnology. 8 (4) :301-310)。同时酶法制糖可使蔗糖的粒状结晶的均匀性、色泽和纯度得到改善。 在大豆及其制品中，含有1%的棉子糖、4%的水苏糖和微量的毛蕊花糖。这些寡糖阻碍人类对豆类的消化吸收，能够产生胀气等疾病，而人胃肠道不分泌a -半乳糖苷酶，因此在豆制品中加入a-半乳糖苷酶，可以分解这些寡糖，增加人类对豆类营养的吸收(Prashanth S J and Mulimani V H. ，Process Biochemistry. 40 :1199-1205)。 a-半乳糖苷酶广泛存在于微生物、植物、动物和人体内。在微生物中，细菌、放线菌、丝状真菌、酵母等都能合成a-半乳糖苷酶。目前，已分离筛选出许多产a-半乳糖苷酶的微生物，如大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌、青霉、红曲霉、米曲霉、黑曲霉、焦曲霉、泡盛曲霉、葡酒色被包霉、毛霉、根霉、黄曲霉、啤酒酵母等等。微生物a-半乳糖苷酶有较高的产量，特别是丝状真菌，每升培养基可以分泌30g蛋白质，它们产生的a -半乳糖苷酶可以分泌到胞外、具有合适的酸碱度和良好的稳定性从而最有利于技术应用(den Herder I. F.，et al.Mol. Gen. Genet. 233,404-410)。因此产a _半乳糖苷酶的真菌受到越来越广泛的关注。由于a-半乳糖苷酶在食品及饲料工业或某些医药领域的应用中，需要具备化学试剂抗性、蛋白酶抗性以加强其应用效果。且在应用过程中，该酶常与包括蛋白酶在内的各种酶混合使用，酶的蛋白酶抗性尤显重要。含有a-半乳糖苷键的寡糖和多聚糖包括多种，而以 前报道的a -半乳糖苷酶其底物特异性不能水解多种底物，在应用上各具有其局限性。 本专利技术公开了一个新的a-半乳糖苷酶基因，其编码的a-半乳糖苷酶具有适宜 的作用PH值，较强的金属离子和表面活性剂抗性，较强的蛋白酶抗性和较好的水解各种底 物的能力，可作为一种新型饲料或食品添加剂应用于饲料与食品行业。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种根霉。 本专利技术的目的之一是提供一种a -半乳糖苷酶AGA36 。 本专利技术的再一目的是提供编码上述a -半乳糖苷酶AGA36的基因。 本专利技术的再一目的是提供包含上述a -半乳糖苷酶AGA36的重组酶。 本专利技术的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。 本专利技术的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。 本专利技术的另一 目的是提供一种制备上述a -半乳糖苷酶AGA36的基因工程方法。 本专利技术的另一目的提供上述a-半乳糖苷酶AGA36的应用。 本专利技术提供了一种根霉AG708(Rhizopus. sp.AG708)，于2008年9月26日保存于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生 物研究所，100101)，其保藏号为CGMCC No. 2675。 本专利技术了提供一种a -半乳糖苷酶AGA36，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。 本专利技术的还提供了编码上述a-半乳糖苷酶的基因aga36，其碱基序列如SEQ IDNO. 2所示。 本专利技术还提供了包含上述a-半乳糖苷酶AGA36的重组酶。 本专利技术还提供了包含a -半乳糖苷酶基因aga36的重组载体。 本专利技术还提供了包含上述a -半乳糖苷酶基因aga36的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。 本专利技术还提供了一种制备a _半乳糖苷酶八6八36的方法，其特征在于，包括以下步 骤 1)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株； 2)培养重组菌株，诱导重组a -半乳糖苷酶表达；以及 3)回收并纯化所表达的a -半乳糖苷酶AGA36。 本专利技术还提供了 a -半乳糖苷酶AGA36的应用。 相较于目前报道或用于生产的a -半乳糖苷酶，该酶具有适宜的作用pH值，抗多 种金属离子和表面活性剂，较强的蛋白酶抗性和优良的水解各种底物的能力，可作为一种 饲料或食品添加剂应用于饲料与食品行业。附图说明 根霉AG708 (Rhizopus. sp. AG708)，于2008年9月26日保存于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所， 100101)，其保藏号为CGMCC No. 2675。 图1重组a -半乳糖苷酶的SDS-PAGE分析，M :低分子量蛋白质Marker ;1 :未诱导 对照，对照空载体pET-22b (+)转化E. coli BL21诱导后的CTP ;2 :载体pET-22b (+) /aga36 转化E. coli BL21诱导后的CTP ;3 :纯化的a -半乳糖苷酶AGA36。 图2显示a -半乳糖苷酶AGA36的最适pH。 图3显示a -半乳糖苷酶AGA36pH稳定性。 图4显示a -半乳糖苷酶AGA36作用的最适温度。 图5显示a -半乳糖苷酶AGA36的热稳定性。 图6显示a -半乳糖苷酶AGA36的蛋白酶抗性分析。具体实施方式 实验条件 1、菌株及载体根霉AG708(Rhizopus. sp.AG708)由专利技术人筛选，宿主大肠杆菌 (Escherichia coli) BL21 (DE3)，载体pET-22b (+)均购自于Invitrogen公司。 2、酶类及其他生化试剂内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公 司。胰蛋白酶(Trypsin) 、 a-糜蛋白酶(a-Chymotrypsin)、蛋白酶K(Proteinase K)、枯 草杆菌蛋白酶A(Subtilisin A)、胶原蛋白酶(Collagenase)为Sigm本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种根霉ＡＧ７０８，其特征在于，保藏号为ＣＧＭＣＣ　Ｎｏ．２６７５。

【技术特征摘要】
一种根霉AG708，其特征在于，保藏号为CGMCC No.2675。2. —种抗蛋白酶的酸性a-半乳糖苷酶AGA36，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。3. —种抗蛋白酶的酸性a-半乳糖苷酶基因aga36，其特征在于，编码权利要求2所述 的a-半乳糖苷酶AGA36。4. 如权利要求3所述的a -半乳糖苷酶基因aga36，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO. 2所示。5. 包含权利要求2所述a -半乳糖苷酶AGA36的重组酶。6. 包含权利要求3或4所述a -半...

【专利技术属性】
技术研发人员：史宝军，胡爱红，罗长财，曹雅男，
申请(专利权)人：广东溢多利生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：44[中国|广东]