本发明专利技术公开了一种核壳结构基因载体系统的组装方法，该方法是将小分子量聚乙烯亚胺（ＰＥＩ）完全开环聚Ｌ－天冬酰亚胺（ＰＳＩ），纯化得α，β－聚Ｌ－天冬酰亚胺－ｇ－聚乙烯亚胺（ＡＥ），以ＡＥ为载体与ＤＮＡ组装成核壳结构的纳米基因载体系统；本发明专利技术的特点是刷状聚阳离子的合成方法简单，成本低廉；由于所用原料无毒，所得刷状聚阳离子基因载体的毒性很低；刷状聚阳离子与ＤＮＡ通过电荷相互作用能形成核壳结构的纳米粒子；该纳米粒子具有高的基因转染效率；基于其亲水的壳层，可减少对蛋白的吸附，从而使该核壳结构的纳米基因载体系统在血浆存在下具有良好的基因转染效率，可望用于体内基因治疗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及纳米生物医药
，具体地说是一种核壳结构基因载体 系统的组装方法及用途。
技术介绍
基因治疗由于可从基因水平治疗或预防先天性遗传疾病或后天获得性疾 病，在生物医药领域开创了一条治疗疾病的革命性的新途径。尽管在过去的20多年，临床试验不下千次，因其效果不理想致使美国食品和药物安全局至 今仍未批准认可任何一个基因治疗方案，因此，提高治疗基因的转染效率及 艽临床安全性依然是具有挑战性的课题。病毒型载体基于转染效率高的优点 应用于大多数临床试验，然而其高免疫原性、致癌性、非导向性、不能多次 用药、制备成本高等缺陷使毒性低、免疫原性低、临床安全性更高、易于制 备的非病毒基因型载体受到更多的关注。基于聚乙烯亚胺(PEI)的聚阳离子因其良好的基因转染效率、结构易于 改造等特点，作为基因载体成为人们广泛研究的对象，但因其易于非特异性 吸附血红蛋白而导致在血浆中的转染效率较低。Kissel等用聚乙二醇修饰PEI(Bioconjugate Chem. 2006， 17, 1209-1218)，以期减少对血红蛋白的吸附， 但却降低了细胞对聚合物/基因复合纳米粒的内吞能力，转染效率不理想。
技术实现思路
本专利技术的目的是利用线形低分子量聚乙烯亚胺(PEI)开环a， (3-聚(L-天冬氨酸)合成刷子状的聚阳离子基因载体，通过低分子量PEI对a， p-聚(L-天冬氨酸)的高接枝率，提高低分子量PEI的质子海绵效应，即提高其基 因转染效率并维持其低毒性。再将刷状聚阳离子a， p-聚(L-天冬氨酸-g-聚乙烯亚胺)(AE)与DNA通过电荷相互作用能自组装形成核壳结构的纳米粒子，该纳米粒子具有高的基因转染效率，因基于其亲水的壳层，可减少对蛋白的 吸附，从而使该核壳结构的纳米基因载体系统在血浆存在下具有良好的基因 转染效率，可望用于体内基因治疗。本专利技术的目的是这样实现的(a) 刷状聚阳离子的合成将毒性低的、小分子量PEI接枝到水溶性好、毒性低的聚合物上，获得水 溶性好、毒性低的刷状聚阳离子。即将小分子量PEI完全开环聚(L-天冬酰亚 胺)(PSI)，纯化得a， P-聚(L-天冬酰亚胺-g-聚乙烯亚胺)(AE);具体是(1) a， p-聚(L-天冬酰亚胺)(PSI)的合成 在1L圆底烧瓶中加入25克(0. 19 mol) L-天冬氨酸粉末和12. 5克85%的磷酸，混合均匀，于旋转蒸发仪上185 。C减压反应3小时至不再有水蒸汽产生为 止，加入150mL二甲基甲酰胺(DMF)溶液搅拌溶解固体物，然后在搅拌下将 得到的溶液缓慢滴加到盛有1000mL水的烧杯中，得白色沉淀，静置，倾去上 清液，过滤，将固体用水洗至中性，于50 。C真空干燥48小时，得粉状固体一 a ， P-聚(L-天冬酰亚胺)(PSI);(2) 、聚乙烯亚胺(PEI)开环a，后-聚(L-天冬酰亚胺) 取低分子量Mm 423的聚乙烯亚胺(PEI)和上步骤得到的a ， 0 -聚(L-天冬酰亚胺)(PSI)、将其分别溶解于二甲基甲酰胺(DMF)溶液，再按摩尔比l :3 (PSI/PEI)混合，于室温下搅拌22h，过滤后，溶液用3500^透析袋 在室温下透析6天，冷冻干燥得刷状聚阳离子(a， (3-聚(L-天冬酰亚胺-g-聚乙烯亚胺)} (AE);(b) 核壳结构基因载体系统的组装将(a)步骤所得刷状聚阳离子(AE)与DNA溶液按N:P比为(5、 10、 20、 30或40充分混合，室温静置24小时，得AE/DNA复合纳米颗粒即为核壳结 构基因载体系统。纳米颗粒的核层由聚乙烯亚胺与DNA通过电荷相互作用形 成的复合物组成，纳米颗粒的壳层由亲水性聚合物构成。所述刷状聚阳离子的分子量不小于10KDa。所述核壳结构基因载体系统用于HeLa、 293T或H印G2细胞的基因转染，尤 其是在血清存在下的基因转染。本专利技术刷状聚阳离子的合成方法简单，成本低廉；由于所用原料无毒， 所得刷状聚阳离子基因载体的毒性很低；该刷状聚阳离子与DNA通过电荷 相互作用能形成核壳结构的纳米粒子；该纳米粒子具有高的基因转染效率； 基于其亲水的壳层，可减少对蛋白的吸附，从而使该核壳结构的纳米基因载 体系统在血浆存在下具有良好的基因转染效率，可望用于体内基因治疗。 附图说明图1为刷状聚阳离子(AE)合成路线图图2为AE的& NMR谱图图3为AE/DNA复合物凝胶电泳图图4为DNA保护和释放实验图图5为N : P = 10时AE/DNA复合物的EF-TEM图图6为AE的细胞毒性，(a) 239T; (b) HeLa; (c) HepG2图7为AE/DNA (pGL3)在不同N : P比对不同细胞系的转染效率，(a) 239T;(b) HeLa;(c) HepG2图8为AE/DNA对HeLa细胞在血清存在下的基因转染效率具体实施方式实施例(x， P-聚(L-天冬氨酸-g-聚乙烯亚胺)(AE)的制备、核壳结构基因载体系统的组装及其结构表征和性能评价(1) 、 (x， |3-聚(L-天冬酰亚胺)(PSI)的合成 在1L圆底烧瓶中加入25克(0.19 mol) L-天冬氨酸粉末和12.5克85。/。的磷酸，混合均匀，于旋转蒸发仪上185 t:减压反应3小时至不再有水蒸汽产生为止。加入150 mL DMF搅拌溶解固体物，然后在搅拌下将得到的溶液缓慢滴 加到盛有1000 mL水的烧杯中，得白色沉淀，静置，倾去上清液，过滤，将 固体用水洗至中性，于50 C真空干燥48小时，得粉状固体(PSI) 17克，产率 93% 。(2) 、小分子PEI (Mn: 423)开a， (3-聚(L-天冬酰亚胺) 先将PEI423和PSI分别溶解于DMF，在按摩尔比1:3 (PSI/PEI)混合，于室温下搅拌22h。过滤后，溶液用3500^透析袋在室温下透析6天，冷冻干燥。 由图2可知，用PEI开环PSI合成的AE具有很高的接枝率。(3) 、凝胶电泳新鲜制备不同N : P比的AE/DNA复合物(纳米颗粒)，室温下放置孵育 20分钟，加入2pl染料，再放置10分钟，将混合溶液装载于含溴化乙锭的琼脂 凝胶上，在TAE电泳缓冲溶液中100V的电压下电泳40分钟后紫外曝光拍照。 由图3可知，PEI423因其分子量小，甚至当N:P比为30时，也不能有效的縮 合DNA。然而，AE/DNA复合物即使N : P比为3， DNA的迁移相当迟缓，说 明AE/DNA复合物对DNA有很强的缩合能力。(4) 、 DNA保护和释放实验N : P比为5的AE/DNA复合物和DNA质粒分别用l(alPBS或DNase-I在DNase/Mg2+消化缓冲溶液中孵育。为使DNase失活和释放DNA，所有样品均 用4iil250mMEDTA处理10分钟，再用8plSDS处理。样品在室温下孵育2h， 然后加入3ial染料，进一步孵育10分钟，将混合溶液装载于含溴化乙锭的琼脂 凝胶上，在TAE电泳缓冲溶液中50V的电压下电泳1小时后紫外曝光拍照。由 图4可知，裸DNA在30min内被DNase-I直接降解，而N : P比为5的AE/DNA 复合物有效保护了DNA以免其被酶水解。(5) 、 EF-TEM观察形貌复合物溶液中DNA的浓度为20 pg/本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种核壳结构基因载体系统的组装方法，其特征在于该方法包括以下步骤： ａ）、刷状聚阳离子｛α，β－聚（Ｌ－天冬酰亚胺－ｇ－聚乙烯亚胺）｝（ＡＥ）的合成 （１）α，β－聚（Ｌ－天冬酰亚胺）（ＰＳＩ）的合成 在１Ｌ圆底烧瓶中加入 ２５克（０．１９ｍｏｌ）Ｌ－天冬氨酸粉末和１２．５克８５％的磷酸，混合均匀，于旋转蒸发仪上１８５℃减压反应３小时至不再有水蒸汽产生为止，加入１５０ｍＬ二甲基甲酰胺（ＤＭＦ）溶液搅拌溶解固体物，然后在搅拌下将得到的溶液缓慢滴加到盛有１０００ｍＬ水的烧杯中，得白色沉淀，静置，倾去上清液，过滤，将固体用水洗至中性，于５０℃真空干燥４８小时，得粉状固体－α，β－聚（Ｌ－天冬酰亚胺）（ＰＳＩ）； （２）、聚乙烯亚胺（ＰＥＩ）开环α，β－聚（Ｌ－天冬酰亚胺） 取低分子量Ｍｎ： ４２３的聚乙烯亚胺（ＰＥＩ）和上步骤得到的α，β－聚（Ｌ－天冬酰亚胺）（ＰＳＩ）、将其分别溶解于二甲基甲酰胺（ＤＭＦ）溶液，再按摩尔比１∶３（ＰＳＩ／ＰＥＩ）混合，于室温下搅拌２２ｈ，过滤后，溶液用３５００＊透析袋在室温下透析６天，冷冻干燥得刷状聚阳离子｛α，β－聚（Ｌ－天冬酰亚胺－ｇ－聚乙烯亚胺）｝（ＡＥ）； ｂ）、核壳结构基因载体系统的组装 将ａ步骤所得刷状聚阳离子（ＡＥ）与ＤＮＡ溶液按Ｎ∶Ｐ比为５、１０、２０、３０、或４０充分混合，室温下静置２４小时，得复合 纳米颗粒即为核壳结构基因载体系统。...
【技术特征摘要】
1、一种核壳结构基因载体系统的组装方法，其特征在于该方法包括以下步骤a)、刷状聚阳离子{α，β-聚(L-天冬酰亚胺-g-聚乙烯亚胺)}(AE)的合成(1)α，β-聚(L-天冬酰亚胺)(PSI)的合成在1L圆底烧瓶中加入25克(0.19mol)L-天冬氨酸粉末和12.5克85％的磷酸，混合均匀，于旋转蒸发仪上185℃减压反应3小时至不再有水蒸汽产生为止，加入150mL二甲基甲酰胺(DMF)溶液搅拌溶解固体物，然后在搅拌下将得到的溶液缓慢滴加到盛有1000mL水的烧杯中，得白色沉淀，静置，倾去上清液，过滤，将固体用水洗至中性，于50℃真空干燥48小时，得粉状固体-α，β-聚(L-天冬酰亚胺)(PSI)；(2)、聚乙烯亚胺(PEI)开环α，β-聚(L-天冬酰亚胺)取低分子量Mn423的聚乙烯亚...
【专利技术属性】
技术研发人员：余家会，范耐茜，王成运，刘顺英，罗淑芳，
申请(专利权)人：华东师范大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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