山羊FAK基因cDNA编码区核苷酸序列制造技术

本发明专利技术涉及从山羊睾丸细胞分离的编码ＦＡＫ蛋白的ｃＤＮＡ的核苷酸序列和与它对应的氨基酸序列。本发明专利技术通过比对已知的牛、人、大鼠、小鼠的ＦＡＫ基因ｃＤＮＡ的核苷酸序列，找到保守区，然后根据牛ＦＡＫ基因ｃＤＮＡ序列（ＧｅｎＢａｎｋ登录号ＢＣ１２０２９７）设计出了一对用于ＲＴ－ＰＣＲ扩增羊ＦＡＫ基因ｃＤＮＡ编码区片段的引物并用这对引物通过ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出了特异性片段，测序后得到了羊ＦＡＫ基因ｃＤＮＡ的编码区的４１８ｂｐ的核苷酸序列和与它的前４１７ｂｐ对应的氨基酸序列。获得的这４１８ｂｐ的核苷酸序列可进一步用于羊ＦＡＫ基因全长ｃＤＮＡ的克隆及用于通过ＲＴ－ＰＣＲ或杂交的方法检测ＦＡＫ基因的组织表达特异性，也可用于重组表达得到蛋白后制备检测ＦＡＫ的抗体。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及从山羊睾丸细胞分离的编码FAK蛋白的cDNA，更具体地说涉及编码FAK蛋白质的 cDNA编码区418bp的核苷酸序列和与它的前417bp对应的氨基酸序列。
技术介绍
细胞生长调控是一个受多因素影响的复杂过程，它不仅受到时间和空间的限制，还受到营养条 件和细胞内外环境条件的影响。在营养条件合适并有其它剌激生长的因子存在时，细胞通过生物大分子合 成而使得质量和形态都得到增长，此时则表现为生长。黏附斑激酶FAK是非受体酪氨酸家族的一员，分子量125KD,在多数细胞中都有表达。具有调节细胞 增殖、迁移、浸润、凋亡、死亡和血管生成的功能。生长因子和细胞黏附能够引起FAK (Tyr397)的磷酸化， 然后导致其它氨基酸残基的磷酸化，包括Tyr407， Tyr576， Tyr 577 , Tyr925等，最后是Tyr861变的高度 磷酸化。FAK不同部位的酪氨酸磷酸化对形成信号复合体的作用不同，可以引起不同的生物学效果。研究表明，在未激活的FAK分子内，氨基端和羧基端结构域相连接，掩蔽了激酶结构域。Tyr397磷酸化 后,FAK发生构象改变,使激酶结构域处于活化状态。活化的FAK进而通过下游的与信号转导有关的多种分 子，激活多条信号转导通路。因此，FAK被认为是整合素依赖性信号转导通路的基础分子,在整合素介导的信 号转导途径中起着关键作用"迄今，关于FAK在哺乳动物细胞生长与增殖中发挥调节作用的研究己在牛、人、大鼠、小鼠和黑猩猩 等哺乳动物的细胞中开展并取得了许多成果，但尚未见山羊细胞中FAK的研究报道，也未见有山羊FAK基 因的cDNA核苷酸序列和与它对应的氨基酸序列的报道。在各种情况下，有重要的原因研究和开发与山羊FAK蛋白相关的基因克隆及其重组表达，因为研究 清楚山羊的FAK基因和蛋白的功能，可以用在提高细胞培养、胚胎移植和发育及出生后新生儿的存活的 质量等方面，由重组FAK蛋白制备的抗体可以检测FAK基因在不同种类的细胞、不同的细胞周期及个体 的不同发育阶段的表达情况
技术实现思路
本专利技术人已经努力从山羊的不同组织细胞中分离FAK基因。作为结果，本专利技术人从山羊睾丸 组织细胞分离了 FAK基因的cDNA编码区418bp片段，并且确定了它的核苷酸序列和由它的前417bp推断 出的氨基酸序列。本专利技术人通过比对己知的牛、人、大鼠和小鼠的FAK基因的核苷酸序列，找到保守区， 然后根据牛的FAK基因(BC120297)cDNA编码区的序列，设计出了一对用于通过RT-PCR方法扩增山羊FAK 基因cDNA编码区片段的引物(上游引物称为P1，下游引物称为P2)，并应用这对引物扩增出了特异性片 段，测序后得到了山羊FAK基因的cDNA编码区418bp片段，序列分析表明与牛的序列(BC120297)同源性 为99%(416/418)，推导出的由此序列编码的氨基酸序列与牛的相比有1个氨基酸的差别。这一 cDNA片 段称为"gFAK"。所以，本专利技术的目的是通过已知的不同物种的FAK的核苷酸序列设计引物，然后通过RT-PCR方法克 隆山羊FAK基因的cDNA编码区片段。对该片段测序后提供编码山羊FAK蛋白的基因的cDNA的编码区 418bp的核苷酸序列和由此推断的氨基酸序列(序列详见序列表)。附图的简要说明从下面给出的说明结合附图，本专利技术的上面目的的特征将变的明了。其中 附图说明图1显示了牛FAK基因的cDNA的核苷酸序列(GenBank登陆号BC120297)。图2显示了417 bp的山羊FAK基因的cDNA的编码区核苷酸序列(SEQ ID NO: 1 )和由此推断的氨基酸 序列(SEQ ID NO: 2)。图3是显示从山羊睾丸组织分离的总RNA的RT-PCR的结果(418 bp的cDNA gFAK)的电泳图。 图4是显示以质粒pMD19-T-gFAK为模板，以Pl、 P2为引物进行PCR鉴定的电泳图。 图5是显示将质粒pMD19-T-gFAK进行酶切鉴定的电泳图。图6显示了山羊FAK基因cDNA的编码区核苷酸序列与牛(BC120297)的FAK基因cDNA的序列的比较。具体实施方式为了从山羊组织细胞中分离FAK基因，本专利技术人首先按照提取RNA的标准要求采集内蒙 古白绒山羊(Inner Mongolia Cashmere Goat， A/rci/s )的各类组织样本。即，现场宰杀内蒙古白絨山羊后立即采取肌肉、肝、肾、淋巴结、脾及睾丸等组织块(将组织块大小控制在30 50ug),放入 冷冻管后立即入液氮保存，带回实验室后置于-80'C冰箱保存备用。然后利用TaKaRa的总RNA提取试剂盒 (TaKaRa RNAiso Reagent)并按照使用说明书的操作程序提取山羊肌肉组织、睾丸组织、肾组织、肝组 织、淋巴结组织及脾脏组织的总RNA，最后根据文献报道的哺乳动物FAK基因在各类组织中的表达情况和 总RNA提取结果，选定以睾丸组织总RNA为模板进行反转录操作，得到cDNA第一链。再以此cDNA第一链 为模板，利用特异性引物P1、 P2进行PCR扩增，得到目的片段。之后将电泳后分离的目的片段切胶回收， 测定双链cDNA的浓度，与pMD19-T克隆载体连接构建成质粒pMD19-T-gFAK。为了检测连接反应是否成功和扩增质粒pMD19-T-gFAK，将其转化f DH5 a感受态细胞，然后将 此被质粒pMD19-T- gFAK转化了的&oh'DH5 a细胞涂在含有氨苄青霉素的选择性平板上，并同时进行蓝、 白菌落筛选。37'C培养16小时后选取白色的重组菌落再进行平板划线培养12小时。作为结果，初步认定 白色菌落为获得的重组菌落。重组菌落和重组质粒pMD19-T-gFAK的进一步鉴定则分为三个步骤进行。首先挑取划线培养的菌落用 Kieser法提质粒，再以此质粒为模板，用特异性引物P1、 P2进行PCR鉴定，阳性的初步认定为重组质粒， 其相应的菌落则为重组菌落。然后，再挑取初步认定为重组的菌落进行液体培养，精提质粒，再以此精提 的质粒为模板进行PCR鉴定，阳性的质粒进一步进行单酶切和五co及I / i/z7rara双酶切鉴定。经过 了 PCR和酶切双重鉴定的质粒确定为重组质粒PMD19-T-gFAK。作为结果，得到了显示阳性反应的重组质 粒和重组菌落。将含有重组质粒pMD19-T-gFAK的fco// DH5 a液体培养的样品送宝生物工程(大连)有 限公司测序。作为结果，获得了418bp的山羊FAK基因cDNA编码区的核苷酸序列。显示上面提到的特征的本专利技术的特异性PCR引物Pl和P2，可以利用RT-PCR方法扩增出山羊的FAK 基因的cDNA编码区片段。根据本专利技术获得的羊FAK基因cDNA的核苷酸序列可进一步通过RT-PCR或杂交 的方法检测FAK基因的组织表达特异性，也可进一步实现羊FAK基因全长cDNA的克隆。将本专利技术的cDNA 重组到表达载体上可能会表达出完整的FAK蛋白，进而可用于抗体生产，检测山羊各类细胞和组织、早 期胚胎、个体在不同状态下的FAK基因的表达情况等等。在下面的实施例中进一步说明了本专利技术，但这并不限制本专利技术的范围。 实施例l:山羊FAK基因的cDNA编码区418bp片段的克隆为了克隆来自山羊本文档来自技高网...

【技术保护点】
本专利技术涉及一段从山羊睾丸细胞分离的编码ＦＡＫ蛋白的ｃＤＮＡ，更具体地说涉及编码ＦＡＫ蛋白质的ｃＤＮＡ编码区核苷酸序列和与它对应的氨基酸序列。目前应用ＲＴ－ＰＣＲ方法克隆基因并获得相应的核苷酸序列是获得基因（ｃＤＮＡ）核苷酸序列的常用方法。本项专利技术设计了一对引物并应用这对引物通过ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出了山羊ＦＡＫ基因ｃＤＮＡ的编码区特异性片段，经过测序后得到这一片段的４１８ｂｐ的核苷酸序列，其特征是在还没有羊ＦＡＫ基因核苷酸序列的情况下，通过比较已知的牛、人、大鼠、小鼠的ＦＡＫ基因的核苷酸序列，找到保守区，然后根据牛ＦＡＫ基因ｃＤＮＡ序列（ＢＣ１２０２９７）设计ＰＣＲ引物，进而通过ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出了山羊ＦＡＫ基因ｃＤＮＡ的编码区片段，测序后得到了４１８ｂｐ的核苷酸序列和与它的前４１７ｂｐ对应的氨基酸序列，这一山羊ＦＡＫ基因ｃＤＮＡ编码区片段的核苷酸序列和与它对应的氨基酸序列在国内外是首次获得。　基于上述说明的本专利技术的技术特征，本专利技术的独立权利要求表述为：一种自山羊分离的多核苷酸序列和与它对应的氨基酸序列，是下列序列之一：１）序列表中ＳＥ Ｑ　ＩＤ　ＮＯ：１的ｃＤＮＡ序列；２）与序列表中ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１的ｃＤＮＡ序列对应的标注为ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２的氨基酸序列。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王志钢，刘东军，旭日干，
申请(专利权)人：王志钢，刘东军，旭日干，
类型：发明
国别省市：15[中国|内蒙]