一种利用穿透型干细胞转录因子诱导体细胞重编程的方法技术

本发明专利技术公开了一种将胚胎干细胞特异的转录因子导入体细胞的方法，包括将细胞穿透肽与胚胎干细胞特异的转录因子融合，获得融合蛋白；将所述融合蛋白与体细胞共孵育，从而胚胎干细胞特异的转录因子被导入体细胞内。本发明专利技术还公开了所述方法获得的细胞。

A method of reprogramming somatic cells using a penetrating stem cell transcription factor

The invention discloses a method for the embryonic stem cell specific transcription factors into somatic cells, including the transcription factor fusion cell penetrating peptide and embryonic stem cell specific, fusion protein were obtained; the fusion protein and somatic cell co incubation, embryonic stem cell specific transcription factor which is introduced into somatic cells. The invention also discloses the cells obtained by the method.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程与组织工程领域，更具体的，本专利技术涉及一种利用细 胞穿透型转录因子诱导体细胞重编程的方法。
技术介绍
诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem cell, iPS)是指将成体分化细胞经 人为诱导转变成多能性干细胞。2006年8月，日本京都大学的Yamanaka课题组首次在CelI上报道，小鼠 成纤维细胞内共表达Oct3/4、 Sox2、 C-myc和Klf4等四种转录因子，可诱发产 生类似胚胎干细胞的iPS。目前，相关的研究已经扩展到了 iPS的适用物种、 可被诱导细胞类型、诱导因子、筛选方法、干细胞功能与特性和移植治疗潜能 等。iPS可方便的直接取材于病人的体细胞，所获得的病人特异性iPS细胞模 型可大大提高药物发现效率，并提供了用于毒性检测的工具；最后，利用iPS 形成与病人具有完全免疫相容性的细胞、组织或器官，将使得基于病人个性化 的药物筛选和治疗策略成为现实，其社会效益和经济前景不可限量。但是目前iPS的研究尚处于起步阶段，仍存在许多问题和困难。例如，诱 导iPS细胞的产生效率低，仅3/1000左右；病毒介导的转基因需整合入宿主细 胞的基因组；干细胞相关转录因子在iPS细胞的分化后代中可被重新激活，引 发诸多异常，如c-myc表达引起肿瘤形成等。这些无疑将严重阻碍iPS细胞的 实际应用和研究。未来iPS应用时需要克服使用有害的癌基因、避免使用逆转 录病毒和开发更强力可靠的去分化方法。综上所述，尽管目前已经证明可以通过干细胞转录因子诱导体细胞重编 程，并转分化为多能性细胞，但现行方法因基于病毒载体而导致产生了很大的 不安全性和不可控性，亟需开发一种更加安全可靠的诱导方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种将胚胎干细胞特异的转录因子导入体细胞的方 法以及利用所述方法获得的细胞。在本专利技术的第一方面，提供一种将胚胎干细胞特异的转录因子导入体细胞 的方法，所述方法包括以下步骤(1) 将细胞穿透肽(cell-penetrating peptide, CPP)与胚胎干细胞特异的转录 因子融合，获得融合蛋白；(2) 将(l)的融合蛋白与体细胞共孵育，从而胚胎干细胞特异的转录因子被 导入体细胞内。在另一优选例中，所述的转录因子选自Oct4、 Sox2、 c-Myc、 n-Myc、 Klf4、 Nanog或Lin2 8。较佳的，所述的转录因子选自Oct4 、 Sox2 、 c-Myc 、 Klf4 、 Nanog 。 更佳的，所述的胚胎干细胞特异的转录因子是Oct4、 Sox2、 c-Myc和Klf4。在另一优选例中，所述的转录因子是人、猪、牛或羊的转录因子。在另一优选例中，所述的体细胞是成纤维细胞，上皮细胞，胃肠道细胞， 神经细胞。较佳的所述的体细胞是成纤维细胞。在另一优选例中，所述的细胞穿透肽选自反式激活蛋白(Transactivator， TAT)、 Penetratin、基于信号序列的肽、pVEC、 Transportan、 Amphiphilic model peptide或Arg9。在另一优选例中，所述的细胞穿透肽是反式激活蛋白。在另一优选例中，所述的细胞穿透肽的羧基端与胚胎干细胞特异的转录因 子的氨基端融合；或者，所述的细胞穿透肽的氨基端与胚胎干细胞特异的转录 因子的羧基端融合。在另一个优选例中，所述的细胞穿透肽的羧基端与胚胎干细胞特异的转录 因子的氨基端融合。在另一个优选例中，所述的反式激活蛋白具有SEQIDNO: 15所示的氨基 酸序列；更佳的，所述的反式激活蛋白的编码基因具有SEQIDNO: 16所示的 核苷酸序列。在另一优选例中，所述的反式激活蛋白的羧基端与胚胎干细胞特异的转录 因子的氨基端融合。在另一优选例中，步骤(1)中，所述获得融合蛋白的方法包括(a) 提供一构建物，所述的构建物中含有一基因表达盒，所述基因表达盒含有以下操作性相连的元件细胞穿透肽编码基因与胚胎干细胞特异的转录因 子编码基因；(b) 将(a)的构建物导入细胞表达系统，从而表达和纯化获得所述融合蛋白。 在另一优选例中，所述的细胞表达系统包括原核表达系统或真核表达系统。在另一优选例中，所述的细胞穿透肽编码基因的3'端与胚胎干细胞特异的 转录因子编码基因的5'端融合；或者，所述的细胞穿透肽编码基因的5'端与胚 胎干细胞特异的转录因子编码基因的3'端融合。较佳的，所述的细胞穿透肽编 码基因的3'端与胚胎干细胞特异的转录因子编码基因的5'端融合。在另一优选例中，釆用原核细胞表达系统(优选大肠杆菌)表达所述的融 合蛋白，采用0.8土0.2mmol/L(较佳的0.8±0. lmmol/L)异丙基P-D硫代半乳糖 苷(IPTG) ， 32±2°C (较佳的32士rC)诱导4土2小时(较佳的4土1小时)。在另一优选例中，尿素的浓度是8±2mol/L;更佳的是8士1 mol/L。在另一优选例中，并采用尿素变性方法对表达获得的融合蛋白包涵体进行 变性，采用Ni-NTA亲和层析纯化；并且在进行尿素变性前，用1±0.3 (较佳的l士0.2;更佳的l士0.1)mol/L的尿 素(含尿素的缓冲液)洗涤包涵体；或采用250土50mmol/L咪唑(含咪唑的缓冲液)洗脱所述融合蛋白。在本专利技术的第二方面，提供一种利用所述的方法获得的细胞。 在另一优选例中，所述的细胞表达胚胎干细胞标记分子；更特别的，所述 的细胞表达Oct4、 Nanog和Fgf4。在本专利技术的第三方面，提供一种诱导体细胞表达干细胞标记分子的方法， 所述的方法包括以下步骤(1) 将细胞穿透肽(cell-penetrating peptide, CPP)与胚胎干细胞特异的转录 因子融合，获得融合蛋白；(2) 将(l)的融合蛋白与体细胞共孵育，从而融合蛋白进入体细胞内，诱导 体细胞表达干细胞标记分子。本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而 易见的。附图说明图h人ES细胞RNA提取电泳图，M为DNA Marker, 1， 2为两个细胞 样本，从电泳可以看出2号样品的提取效果较好，适于后续实验。图2A: 1为Oct4 PCR产物电泳图，片段大小为1096bp; 2为Sox2 PCR 产物电泳图，片段大小为956 bp; M为DNAMarker。图2B: 1为C-myc PCR产物电泳图，片段大小为1372bp。M为DNA Marker。 图2C: 1为Klf4PCR产物电泳图，片段大小为1438bp; M为DNA Marker。图3: l-4依次为pETs、pETc、pETo禾QpETk转染BL21表达菌株后经IPTG 诱导表达的产物，5为未转染质粒的BL21表达菌株，6为IPTG诱导未转染质 粒的BL21表达菌株，M为蛋白分子量标准。图4: M为蛋白质分子量标记；1-4， 5-8依次为含尿素浓度为1， 2， 3， 4mo1/1的缓冲液洗涤结果，其中l-4为洗涤离心后上清样品；5-8为洗涤离心后 沉淀样品；箭头所指为目的蛋白Sox2分子量大小约为40kD。图5A:纯化Oct4重组蛋白电泳结果图，1为上样液，2为流穿液，3-10 为洗脱峰不同时段样品；图5B:纯化Sox2重组蛋白电泳结果图，l为上样液，2， 3为流穿液，4本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种将胚胎干细胞特异的转录因子导入体细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：　（１）将细胞穿透肽与胚胎干细胞特异的转录因子融合，获得融合蛋白；　（２）将（１）的融合蛋白与体细胞共孵育，从而胚胎干细胞特异的转录因子被导入体细 胞内。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：成国祥，刘思国，陈建泉，张琦，
申请(专利权)人：上海转基因研究中心，上海杰隆生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]