一种利用RNAi调控内源性朊蛋白表达的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种利用RNAi调控内源性朊蛋白表达的方法及其应用。具体地，经过大量筛选，本发明专利技术人获得多个针对朊蛋白基因的特异siRNA序列，并构建了含所述siRNA序列的表达载体，将该载体转入宿主细胞，可以获得内源性朊蛋白被高效抑制的细胞株，该细胞株可降低对PrPsc病毒的易感性。用所述细胞株可以获得内源性朊蛋白被有效抑制的转基因动物。

【技术实现步骤摘要】
一种利用RNAi调控内源性朊蛋白表达的方法及其应用
本专利技术属于动物学和基因工程领域，具体地，本专利技术涉及一种利用RNAi调控内源性朊蛋白表达的方法及其应用。
技术介绍
朊蛋白类疾病(priondiseases)，又叫传染性海绵状脑病(TransmissibleSpongiformEncephalopathies，TSE)，是一类致命的中枢神经系统退行性疾病。该疾病的主要特点是神经细胞死亡、大脑空泡化以及伴随的星型胶质细胞增生等，这些将导致运动障碍、痴呆，最终导致患病动物的死亡。为大家比较熟悉的朊蛋白类疾病主要有：发生在绵羊和山羊上的羊搔痒病(scrapie)、发生在牛身上的牛海绵状脑病(BovineSpongiformEncephalopathy，BSE，即俗称的“疯牛病”)、以及发生在人身上的库鲁氏病(Kuru)、克雅氏病(Creutzfeldt-Jakobdisease，CJD)、Gerstrnann-Straussler-Sheinkerdisease(GSS)、致死性失眠综合症(fatalfamilialinsomnia，FFI)、新型克雅氏病(VariantCreutzfeldt-Jakobdisease，vCJD)等(参见PrusinerSB：Prions.ProcNatlAcadSci，USA1998，95：13363-13383)。目前己有很多证据表明，发生在牛身上的牛海绵状脑病可以通过一定途径传染给人，并在人身上引起一种新型的克雅氏病((vCJD)，由于朊蛋白类疾病至今仍然没有有效的治疗手段，该疾病到目前为止已经导致了大量的人员伤亡死亡，在全球范围内也引起恐慌，并导致数百万头牛羊被屠宰，造成了巨大的经济损失。朊蛋白类疾病的病原体为PrPSC。PrPSC是细胞内正常表达的朊蛋白(PrPC)的异构体，PrPSC异构体富含β-折叠，并具有抵抗蛋白酶消化的能力。当作为病原体的PrPSc进入体内后，会引起PrPC转变成PrPSc，从而使PrPSc得到增殖。羊搔痒病是一种在绵羊或山羊身上自发产生的、可以在羊群之间互相传染的朊蛋白类疾病，也是第一个通过人工接种方法成功传播给啮齿类动物的朊蛋白类疾病，因而羊搔痒病常被用作TSE疾病研究的原型(ChandlerRL：Encephalopathyinmiceproducedbyinoculationwithscrapiebrainmaterial.Lancet1961，1：1378-1379)。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)一种由双链RNA引发的转录后基因沉默机制，是近年来发展起来的一项新技术。RNAi应用于哺乳动物细胞主要是通过体外合成小干扰RNA(siRNA)或体内表达短发夹结构RNA(shRNAs)两种途径来完成。为了达到长期稳定的沉默效果，人们常通过构建shRNA表达载体转染细胞的方法抑制特定基因的表达。但是本领域尚缺乏朊蛋白类疾病(尤其是羊搔痒病)防治的方法，也没有有效针对内源朊蛋白基因序列的RNA干扰分子和shRNA表达载体。因此本领域迫切需要开发PrP基因靶向的干扰RNA和表达载体，从根本上杜绝朊蛋白类疾病的发生。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种利用RNAi调控内源性朊蛋白表达的方法及其应用。在本专利技术的第一方面，提供了一种dsRNA构建物，所述dsRNA构建物为双链，并且其正链或负链含有式I所示的结构：Seq正向-X-Seq反向式I式中，Seq正向为PrP基因或PrP基因片段；Seq反向为与Seq正向基本上互补的核苷酸序列；X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补。在另一优选例中，所述PrP基因片段的序列如SEQIDNO.：1-14任一所示。在另一优选例中，所述PrP基因片段的序列如SEQIDNO.：4、SEQIDNO.：9、SEQIDNO.：11、或SEQIDNO.：13所示。在另一优选例中，所述间隔序列X的长度为1-100bp，较佳地为4-10bp。在另一优选例中，所述PrP基因或PrP基因片段来源于羊、牛、猪、兔或鼠，较佳地来源于羊。在另一优选例中，所述dsRNA构建物在宿主细胞中形成式II所示的dsRNA：式II式中，Seq’正向为Seq正向序列对应的RNA序列或序列片段；Seq’反向为与Seq’正向基本上互补的序列；X’为无；或为位于Seq’正向和Seq’反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq’正向和Seq’反向不互补，||表示在Seq’正向和Seq’反向之间形成的氢键。在本专利技术的第二方面，提供了一种dsRNA，所述dsRNA具有式II所示的结构：式II式中，Seq’正向为与PrP基因或PrP基因片段的核苷酸序列对应的RNA序列或序列片段；Seq’反向为与Seq’正向基本上互补的序列；X’为无；或为位于Seq’正向和Seq’反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq’正向和Seq’反向不互补；||表示在Seq’正向和Seq’反向之间形成的氢键。在另一优选例中，所述PrP基因片段的序列如SEQIDNO.：1-14任一所示。在另一优选例中，所述PrP基因片段的序列如SEQIDNO.：4，SEQIDNO.：9，SEQIDNO.：11，或SEQIDNO.：13所示。在另一优选例中，所述间隔序列X的长度为1-100bp，较佳地4-10bp。在另一优选例中，所述PrP基因或PrP基因片段来源于羊、牛、猪、兔或鼠，较佳地来源于羊。在本专利技术的第三方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有本专利技术的第一方面所述的dsRNA构建物。在另一优选例中，所述表达载体具有选自下组的启动子：U6启动子、H1启动子、或RNA聚合酶II启动子。在另一优选例中，所述的U6启动子来源于人、羊、牛、或鼠，更佳地来源于人。在另一优选例中，所述的H1启动子来源于人。在另一优选例中，所述的表达载体为病毒载体或质粒载体。在另一优选例中，所述的病毒载体为慢病毒载体及腺病毒载体。在本专利技术的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞中含有本专利技术第三方面所述的表达载体或者染色体中整合有对应于本专利技术第一方面所述的dsRNA构建物的DNA序列。在另一优选例中，所述宿主细胞整合有对应于本专利技术第一方面所述的dsRNA构建物的DNA序列。在另一优选例中，所述宿主细胞的PrP基因被失活或被抑制，较佳地，抑制效率≥90％。在另一优选例中，所述宿主细胞为动物细胞，较佳地为山羊胎儿成纤维细胞。在另一优选例中，所述的宿主细胞用于制备转基因动物。在本专利技术的第五方面，提供了一种组合物，所述的组合物包括本专利技术第一方面所述的dsRNA构建物和/或本专利技术的第二方面所述的dsRNA，以及动物喂食上可接受的载体。在另一优选例中，所述动物喂食上可接受的载体包括水。在另一优选例中，所述的组合物是用于抑制动物内源PrP基因表达的组合物。在另一优选例中，所述的dsRNA具有对应于SEQIDNO.：4，SEQIDNO.：9，SEQIDNO.：11，或SEQIDNO.：13所示的序列。在本专利技术的第六方面，提供了第一方面所述的dsRNA构建物，或第二方面所述的dsRNA，或第三方面所述的表达载体，或第五方面所述组合物的用途：用于制备抑制本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种dsRNA构建物，其特征在于，所述dsRNA构建物为双链，并且其正链或负链含有式I所示的结构：Seq正向?X?Seq反向??????式I式中，Seq正向为PrP基因或PrP基因片段；Seq反向为与Seq正向基本上互补的核苷酸序列；X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补。

【技术特征摘要】
1.一种dsRNA构建物，其特征在于，所述dsRNA构建物为双链，并且其正链或负链含有式I所示的结构：Seq正向-X-Seq反向式I式中，Seq正向为PrP基因或PrP基因片段；Seq反向为与Seq正向基本上互补的核苷酸序列；X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补，其中，所述PrP基因片段的序列如SEQIDNO.:4、5、11、13中任一所示。2.如权利要求1所述的构建物，其特征在于，所述PrP基因片段的序列如SEQIDNO.:5或SEQIDNO.:13所示。3.如权利要求1所述的构建物，其特征在于，所述间隔序列X的长度为1-100bp。4.如权利要求3所述的构建物，其特征在于，所述间隔序列X的长度为4-10bp。5.如权利要求1所述的构建物，其特征在于，所述PrP基因或PrP基因片段来源于羊、牛、猪、兔或鼠。6.如权利要求5所述的构建物，其特征在于，所述PrP基因或PrP基因片段来源于羊。7.如权利要求1所述的dsRNA构建物，其特征在于，所述dsRNA构建物在宿主细胞中形成式II所示的dsRNA：式中，Seq’正向为Seq正向序列对应的RNA序列或序列片段；Seq’反向为与Seq’正向基本上互补的序列；X’为无；或为位于Seq’正向和Seq’反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq’正向和Seq’反向不互补，||表示在Seq’正向和Seq’反向之间形成的氢键。8.一种dsRNA，其特征在于，具有式II所示的结构：式中，Seq’正向为与PrP基因或PrP基因片段的核苷酸序列对应的RNA序列或序列片段；Seq’反向为与Seq’正向基本上互补的序列；X’为无；或为位于Seq’正向和Seq’反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq’正向和Seq’反向不互补；||表示在Seq’正向和Seq’反向之间形成的氢键，其中，所述PrP基因片段的序列如SEQIDNO.:4、5、11、13中任一所示。9.如权利要求8所述的dsRNA，其特征在于，所述PrP基因片段的序列如SEQIDNO.:5或SEQIDNO.:13所示。10.如权利要求8所述的dsRNA，其特征在于，所述间隔序列X的长度为1-100bp。11.如权利要求10所述的dsRNA，其特征在于，所述间隔序列X的长度为4-10bp。12.如权利要求8所述的dsRNA，其特征在于，所述PrP基因或PrP基因片段来源于羊、牛、猪、兔或鼠。13.如权利要求12所述的dsRNA，其特征在于，所述PrP基因或PrP基因片段来源于羊。14.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求1所述的dsRNA构建物。15.如权利要求14所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体具有选自下组的启动子：U6启动子、H1启动子、或RNA聚合酶II启动子。16.如权利要求15所述的表达载体，其特征在于，所述的U6启动子来源于人、羊、牛、或鼠。17.如权利要求16所述的表达载体，其特征在于，所述的U6启动子来源于人。18.如权利要求15所述的表达载体，其特征在于，所述的H1启动子来源于人。19.如权利要求14所述的表达载体，其特征在于，所述的表达载体为病毒载体或质粒载体。20.如权利要求19所述的表达载体，其特征在于，所述的病毒载体为慢病毒载体及腺病毒载体。21.一种宿主细胞，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：成国祥，俞慧清，陈建泉，王学斌，
申请(专利权)人：上海转基因研究中心，上海杰隆生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：