本发明专利技术涉及“一种人羊膜组织来源间充质细胞提取及传代培养方法”属于再生医学工程领域。羊膜组织来源间充质细胞ｈＡＭＣｓ的提取方法，包括去除羊膜上皮细胞和分离纯化间充质细胞步骤，其特征在于：所述分离纯化间充质细胞步骤中是采用０．１％胶原酶Ⅲ、ＩＶ和Ｖ进行消化处理；间充质细胞ｈＡＭＣｓ的体外传代培养方法，采用ＤＭＥＭ／Ｆ↓［１２］培养基，所述该培养基中加入有生长因子和羊膜上皮细胞培液的上清液。本发明专利技术的提取方法，其分离程度高，能够从３０ｍｌ体积的羊膜组织中最大限度获取１×１０↑［７］／ｃｅｌｌｓ数量的细胞，细胞成活率大于９０％。本发明专利技术的传代培养方法，使间充质细胞的增殖又快又好，在培养了３５天还有增殖趋向。
Human amniotic membrane tissue derived mesenchymal cell extraction and subculture method
The invention relates to an extraction, passage and culture method for mesenchymal cells derived from human amnion tissue, which belongs to the field of regenerative medical engineering. Extraction of amnion derived mesenchymal hAMCs cells, including the removal of amniotic epithelial cells and mesenchymal cell separation and purification steps, which is characterized in that the isolation and purification of mesenchymal cells is the use of 0.1% step collagenase III, IV and V were digested; mesenchymal cells hAMCs in vitro culture method using DMEM / F, down 12 medium, the culture supernatant with growth factor and amniotic epithelial cell culture liquid medium. An extraction method of the invention, the high degree of separation, from 30ml volume of amniotic tissue maximum 1 x 10 = 7 / cells cell number, cell survival rate is more than 90%. The passage culture method of the invention enables the proliferation of mesenchymal cells to be fast and good, and has a proliferation tendency for 35 days.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及再生医学工程领域，特别是人羊膜间充质细胞(Human amniotic mesenchymal cells, hAMCs)作为细胞移植和组织工程组织构建的细胞来源，为组织修复和组织再造提供 新途径。
技术介绍
间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)作为一种多潜能细胞，由于其在体内所 定居的组织不同，微环境中的细胞因子、生长因子等各种调控物质不同，可促进MSCs向不 同的谱系分化。体外培养时，在不同的诱导条件下MSCs能够向不同的组织分化，不仅可分 化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞和肌肉细胞等，而且还可以跨胚层分化，如可以分化为 外胚层的神经元、神经胶质细胞及内胚层的肝细胞等。人羊膜间充质细胞(Human amniotic mesenchymal cells, hAMCs)是间充质细胞的一类， Gianandrea等(Gianandrea Pasquinelli ， Pierluigi Tazzari ， Francesca Ricci ， et al。 Ultrastructural Characteristics of Human Mesenchymal Stromal (Stem) Cells Derived from Bone Marrow and Term Placenta。 Ultrastructural Pathology, 2007， 31: 23 - 31)通过应用透射电镜对hAMCs的超 微结构进行研究，发现hAMCs表现为具有上皮和间质特征的超微结构，上皮样特征包括非 肠腔型表面微绒毛、细胞间连接，间质特征包括rEF轮廓、脂滴等，这些特点从结构上阐 述了其具有多项分化潜能。Sakuragawa等(Sakuragawa N， Kakinuma K, Kikuchi A, Okano H， Uchida S,K咖o I, et al. Human amnion mesenchyme cells express phenotypes of neuroglial progenitor cells. J Neurosci Res. 2004;78:208-214. Erratum in: J Neurosci Res, 2005;79:72)发现未分化hAMCs表达神经前 体细胞表型，87.7%的表达巢蛋白，93.1。/。表达musashil，用神经细胞诱导剂后出现双极或多 极突起，巢蛋白和musashil表达程度增加。hAMCs还可以被抗-Tuj 1、抗-NF-M和抗-GFAP 染色，并且诱导后阳性染色细胞数将明显增加，Tuj 1、 NF-M和GFAP均是神经细胞的特异 性标志，这些结果表明在合适的培养条件下，hAMCs可以分化为神经细胞。有人(Zhao P, Ise H, Hongo M， Ota M, Konishi I， Nikaido T. Human amniotic mesenchymal cells have some characteristics of cardiomyocytes. Transplantation. 2005, 79:528-535)把hAMCs 与新生鼠心脏分离块共同培养并植入发生心肌梗死的鼠心脏，hAMCs表达心脏特异性转录因 子GATA4、心脏特异性基因、L-型心脏特异性钙通道a单位(ale)和一过性外向性钾离子 通道(Kv4.3)，同时发现经b-FGF诱导后，hAMCs表达心肌特异性转录因子Nkx2.5、心脏3特异性标志心钠素，经activinA诱导后表达心脏特异性基因a肌球蛋白重链(a-MHC)。hAMCs 在心肌梗死的瘢痕组织中能存活至少2个月，能与心肌组织整合并分化成为心肌样细胞。Tomoharu(Tomoharu TAMAGAWA, Satoshi 01， Isamu ISHIWATA, et al。 Differentiation of mesenchymal cells derived from human amniotic membranes into hepatocyte-like cells in vitro 。 Human Cell ， 2007; 20: 77-84)发现hAMCs在诱导分化之后表达葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)、 鸟氨酸氨氨甲酰基转移酶(OTC)和肝细胞核移植4a (HNF-4a)的mRNA，并且具有储存糖原 的功能，而该功能是肝细胞的特异性功能之一，说明hAMCs可以分化成为肝细胞样细胞。hAMCs还可以分化成为软骨细胞(YashM.Kolambkar， Alexandra Peister ， Shay Soker， et al。 Chondrogenic differentiation of amniotic fluid-derived stem cells。 J Mol Hist， 2007， 38:405413)，并表达软骨相关基因。此外来源于羊膜的MCs在体外可以自发分化形成血管内 皮细胞，加入血管内皮生长因子(VEGF)可以促进这一过程。综上所述，hAMCs具有多向分化潜能，因此在组织损伤再生和修复重建中具有广阔的 应用前景。鉴于羊膜组织来源间充质细胞'(hAMCs)不表达端粒酶活性，尚不能确认其为间充质干 细胞，但此类细胞表达胚胎干细胞、间质干细胞以及神经干细胞特异性标记蛋白，具有低分 化原始细胞功能，在特定培养条件下具有多分化功能，为此我们可以利用其治疗器官缺损及 功能丧失等退行性疾病，如骨和软骨缺损、心肌梗塞、缺血性脑损伤和急性肝功能衰竭等。 其原理初步断定，由组织营养和细胞替代作用达到组织整合与器官修复的目的。
技术实现思路
针对羊膜组织来源间充质细胞(hAMCs)的上述特点和优点，本专利技术提供一种hAMCs 提取方法，其分离程度高，同时还提供一种传代培养方法，使间充质细胞的增殖又快又好。羊膜组织来源间充质细胞hAMCs的提取方法，包括去除羊膜上皮细胞和分离纯化间充 质细胞步骤，其特征在于所述分离纯化间充质细胞步骤中是采用0.1%胶原酶111 、 IV和V 进行消化处理。所述胶原酶III 、 IV和V的重量比为l: 1: 1.5。所述消化处理方法为37。C震摇30min，转速400 600rpm。间充质细胞hAMCs的体外传代培养方法，釆用DMEM/Fu培养基，所述该培养基中加 入有生长因子和羊膜上皮细胞培液的上清液。所述生长因子的加入量为30-100ug/L ，羊膜上皮细胞培养液的上清液的加入量为5-20% (v/v)。培养条件为38.5°C， 5%C02，饱和湿度的C02培养箱中培养，隔天换液。所述培养基中还添加有生物活性因子。 所述生物活性因子为EGF、 bFGF、 TGF-P或/和IGF。人羊膜是一种天然高分子生物材料，有厚的基底膜，含m、 IV、 V型胶原、糖蛋白、蛋 白多糖、整合素和层粘连蛋白等多种成分，任何组织包括羊膜组织的细胞外基质成分包裹于 细胞周围，在分离hAMCs过程中如何消化细胞外基质成分是影响细胞分离质量和数量的关 键问题。也就是说在对组织进行处理时，既要破坏组织让细胞释放出来，又要保证细胞的活 本文档来自技高网...
【技术保护点】
羊膜组织来源间充质细胞ｈＡＭＣｓ的提取方法，包括去除羊膜上皮细胞和分离纯化间充质细胞步骤，其特征在于：所述分离纯化间充质细胞步骤中是采用０．１％胶原酶Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ进行消化处理。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李荣旗，
申请(专利权)人：李荣旗，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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