新型牛卵母细胞体外成熟培养液制造技术

本发明专利技术涉及“新型牛卵母细胞体外成熟培养液”属于胚胎工程领域。本发明专利技术在常规的ＩＶＭ培养液中添加羊膜上皮细胞或其培养液的上清液，建立牛未成熟卵母细胞ＩＶＭ培养新体系，以提高ＩＶＭ牛卵母细胞质量和成熟率，解决目前培养方法中受精率低和囊胚形成率低的问题。

A new culture medium for bovine oocyte maturation in vitro

The present invention relates to a new bovine oocyte IVM medium, and belongs to the field of embryo engineering. The present invention cultured with amniotic epithelial cells or cultured supernatant in conventional IVM, establish bovine immature oocytes cultured in IVM system in order to improve the quality of IVM in bovine oocytes and mature rate, to solve the current training methods in the low fertilization rate and blastocyst formation rate of the problem of low.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及胚胎工程领域，特别是涉及牛卵母细胞体外成熟液。
技术介绍
作为胚胎生物工程技术研究的基础之一的牛卵母细胞体外成熟培养技术，自上世纪30年代起至今，许多科学研究人员在牛卵母细胞体外生长、发育领域做了大量工作，对牛卵母细胞培养条件进行了广泛而深入地研究，并取得了较大的进展，目前牛卵母细胞体外成熟(hvramatrue ， IVM)培养技术体系已建立，但由于卵母细胞成熟机理、成熟调控方面尚存在许多尚未阐明和一些亟待解决的问题，以致目前现行方法存在对卵母细胞质量要求高，体外受精率和囊胚形成率低等问题。羊膜形成于原肠胚之前的受精第8天，羊膜组织细胞保持有前原肠胚胚胎细胞的可塑性，羊膜组织主要由来源于外胚层的羊膜上皮(amniotic epithelial cells, AECs)和来源于中胚层的羊膜间充质(amniotic mesenchyme cells, AMCs) 2类细胞组成(Whittle WL, Gibb W, ChallisJR.: The characterization of human amnion epithelial and mesenchymal cells: the cellularexpression, activity and glucocorticoid regulation of prostaglandin output. Placenta. 2000May;21(4):394-401.)，羊膜上皮细胞具有三种胚原基层细胞的分化潜能，内胚层(肝、胰)、中胚层(心肌细胞)和外胚层(神经细胞)(MikiT，LehmannT,CaiH，etal.: Stem CellCharacteristics of Amniotic Epithelial Cells. Stem Cells. 2005 Aug 4; [Epub ahead of print])。羊膜上皮细胞具有合成释放儿茶酚胺(Elwan MA. :Synthesis of dopamine fromL-3,4-dihydroxyphenylalanine by human amniotic epithelial cells. Eur J Pharmacol. 1998 Jul3 l;354(l》Rl-2; Elwan MA, Ishii T, Sakuragawa N. et al.: Characterization of the dopaminetransporter gene expression and binding sites in cultured human amniotic epithelial cells. NeurosciLett. 2003 May 15;342(l-2):61-4.)、乙酰胆碱(Horikoshi T, Fujii T， Kawashima K, et al.:Acetylcholine increase in amniotic fluid of experimental rats for intrauterine growth retardation.Life Sci. 2003 Mar 28; 72(18-19): 2145-9; Uchida S， Suzuki Y， Araie M， Kashiwagi K, et al.:Factors secreted by human amniotic epithelial cells promote the survival of rat retinal ganglion cells.Neurosci Lett. 2003 Apr 24;341(l):l-4.)神经递质的神经生物学功能，还可以分泌神经营养因子等生物活性物质，具有神经营养功能。目前已检测到脑源性神经营养因子(brain-derivedneurotrophic factor, BDNF)、 NT-3、神经生长因子(nerve growth factor, NGF)和睫状神经营 养因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF) (Uchida S, Suzuki Y, Araie M, Kashiwagi K， et al.: Factors secreted by human amniotic epithelial cells promote the survival of rat retinal ganglion cells, Neurosci Lett. 2003 Apr 24;341(l):l-4; Marvin KW, Keelan JA, Eykholt RL, et al.: Expression of angiogenic and neurotrophic factors in the human amnion and choriodecidua. Am J Obstet Gynecol. 2002 Sep;187(3):728-34.)，提示羊膜组织通过分泌释放神经营养因子进入羊水，对胚胎神经发 育的早期阶段具有重要调节作用(Uchida S, Inanaga Y, Kobayashi M, et al.: Neurotrophic function of conditionedmedium from human amniotic epithelial cells. J Neurosci Res. 2000 Nov 15;62(4):585-卯.)。此外，羊膜上皮细胞还可以分泌合成TGF、 EGF、 bFGF禾P HGF等生长因 子，因此应该可以运用去细胞羊膜基质作为滋养层促进体外培养胚胎干细胞的分化，运用羊 膜组织提取物促进未成熟卵细胞体外成熟。综上所述，羊膜上皮细胞可能分泌的已知和某些 未知生物活性物质，能够正向调节培养细胞的生物学特性。
技术实现思路
针对牛卵母细胞受精率低和囊胚形成率低的问题，结合羊膜上皮细胞的特点，本专利技术提 供一种新型牛卵母细胞体外成熟培养液，提高了牛卵母细胞成熟率、卵母细胞受精率和囊胚 形成率。新型牛卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于在IVM培养基内添加羊膜上皮细胞或/ 和羊膜上皮细胞培养液的上清液。所述羊膜上皮细胞培养液的上清液为培养5-7天的羊膜上皮细胞的上清液。 所述羊膜上皮细胞培养液的上清液的加入量为100ml IVM培养基中加入2-20ml羊膜上皮 细胞培养液的上清液.所述羊膜上皮细胞为l-7代的羊膜上皮细胞。 所述羊膜上皮细胞为人或牛的羊膜上皮细胞。所述IVM培养基为M199+10% FBS+10吗/ml FSH+0.1吗/ml LH+l吗/ml E2。利用上皮细胞的特性，我们在体外培养羊膜上皮细胞，最后分离得到羊膜上皮细胞和羊 膜上皮细胞培养液的上清液，将其添加到IVM培养液中构成新型牛卵母细胞体外成熟培养 液。羊膜上皮细胞和羊膜上皮细胞培养液的上清液对牛卵母细胞成熟进行正向调节，羊膜上皮分泌、合成牛卵母细胞体外成熟生物活性物质，从而提高牛卵母细胞成熟率，实验证明与原IVM培养液相比，新型牛卵母细胞体外成熟培养液能提高卵母细胞受精率和囊胚形成本专利技术在常规的IV本文档来自技高网...

【技术保护点】
新型牛卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于：在ＩＶＭ培养基中添加羊膜上皮细胞或／和羊膜上皮细胞培养液的上清液。

【技术特征摘要】
1、新型牛卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于在IVM培养基中添加羊膜上皮细胞或/和羊膜上皮细胞培养液的上清液。2、 根据权利要求1所述的新型牛卵母细胞体外成熟培养液，所述羊膜上皮细胞培养液 的上清液为培养5-7天的羊膜上皮细胞的上清液。3、 根据权利要求2所述的新型牛卵母细胞体外成熟培养液，所述羊膜上皮细胞培养液 的上清液的加入量为100mlIVM培养基中加入2-20ml羊膜上...

【专利技术属性】
技术研发人员：李荣旗，
申请(专利权)人：李荣旗，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]