本发明专利技术公开一种利用3D打印技术促进人未成熟卵母细胞体外成熟的方法。该方法是将临床采集分离得到的颗粒细胞首先采用体外培养的方法进行增殖，培养2～7天；将生物水凝胶与预处理后的颗粒细胞混合均匀，采用生物3D打印出人造卵泡；在人造卵泡中加入含体积百分含量≥10﹪人成熟卵泡液的培养液，培养24～48h后加入未成熟卵母细胞-卵丘颗粒细胞复合体，3D细胞培养24～48小时帮助其成熟。本发明专利技术采用3D含细胞打印技术，采用人体颗粒细胞来构建未成熟卵母细胞3D培育系统，同时加入多种生长因子和模拟卵泡培养液，创造出一个真实模拟人体内卵泡的环境来促使未成熟卵母细胞的体外成熟。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物3D打印
，涉及生物材料的机械加工及其应用，具体是一种利用3D打印技术制备人造卵泡来促进未成熟卵母细胞体外成熟的方法。
技术介绍
据统计，我国育龄人群中不孕不育率已高达12.5 %，全国有近5000万不孕不育患者，成为了一个重大的社会问题，值得整个社会高度重视。现代辅助生殖(IVF)的提出为不孕不育患者解决生育问题带来了希望，通过控制性超排卵获得更多可利用的成熟卵母细胞，再通过精子显微注射技术进行人工体外受精，最后将体外培养的受精卵植回女性子宫中发育成胚胎。然而超促排卵药物的高昂费用以及频繁的就诊次数增加了患者的负担，此类药物对卵巢的刺激更可能导致恶心、腹痛、情绪不佳、闭经、卵巢过度刺激综合症(OHSS)以及潜在的致癌风险。因此将未成熟的卵母细胞进行体外培养后，再进行体外受精和胚胎移植，最终获得妊娠成为了一条可行的解决方案。这一体外培育未成熟卵母细胞的技术的提出，可以规避上述的种种副作用和并发症发生的可能性，同时简化治疗流程，减少就诊率，降低医疗费用，可以大大减轻患者的负担。因此对于该项技术的研究可以为部分不孕患者提供一条新的治疗途径，具有广泛的临床应用价值。多囊卵巢综合症(PCOS)是一种生殖功能障碍与糖代谢异常并存的内分泌紊乱综合症，是女性不孕的一大原因。其主要特征是持续性无排卵以及产生多个不成熟卵泡。研究表明，PCOS症下的不成熟卵泡中的卵母细胞，经过体外培养后可以转化为成熟卵母细胞，经过体外受精后可以产生妊娠。因此卵母细胞体外成熟技术的研究也为解决由PCOS所导致的女性不育问题提供了一条出路。目前卵母细胞体外培养的方法主要是将卵母细胞与颗粒细胞的混合物吸出后用透明质酸酶剥离卵母细胞周围的颗粒细胞，再将卵母细胞移植到平皿中，加入模拟卵泡液进行二维贴壁式培养。但是因为促进卵母细胞体外成熟的机制尚不清楚，采用二维贴壁式培养下获得的卵母细胞成熟质量、卵裂率、受精率和种植率均不尽如人意。其原因很可能是因为体外二维培养条件和培养液中所含的成分不支持卵母细胞完成复杂的成熟过程，卵母细胞存在胞核和胞质不能同步成熟的问题。因此选择一个更加接近于人体内卵泡微环境的培养系统是IVM成功的关键。在人体中，卵母细胞所处的卵泡微环境是由颗粒细胞以及各种促性腺激素所组成的动态微环境，其中卵母细胞需要通过卵丘颗粒细胞提供发育所必需的营养物质和调节信号，以增加卵母细胞的表面积，借助旁分泌作用调节卵母细胞的发育。一项研究发现，体外培养小鼠裸卵只有少量可以逐步发生生殖泡破裂(GVBD)，但不足以最终完成减数分裂。而含有卵丘颗粒细胞的颗粒细胞-卵母细胞复合体在hCG、EGF、FSH、LH等激素的共同作用下培养13-15天后，有高达86 % -95 %的细胞会发生GVBD，并能够完成减数分裂。颗粒细胞所分泌的生长因子与激素类物质可以直接作用并导致卵母细胞的成熟，因此创造一个含颗粒细胞的卵母细胞体外促成熟模型就显得非常有必要。这一体外模型，可以帮助我们更好得认识颗粒细胞对于卵母细胞体外成熟所起的重要作用，研究卵母细胞体外成熟的分子机制，从而构建更加科学合理的卵母细胞体外培养促成熟系统。现有的研究表明，很多因素可能影响到卵母细胞的体外培养促成熟过程。促性腺激素(黄体生成素和卵泡刺激素)对于卵泡的发展是必需的。卵泡刺激素(FSH)可以使得卵丘颗粒细胞扩展，中断卵丘细胞核卵母细胞之间的连接，阻碍卵丘颗粒细胞内的信号传入卵母细胞从而解除其对卵母细胞减数分裂的抑制作用。黄体生成素(LH)可以通过旁分泌途径诱导颗粒细胞分化，刺激卵母细胞合成周期素B，进而激活成熟分裂促进因子(MPF)，使得核膜破裂和组蛋白I磷酸化，促使染色体浓缩和纺锤体的形成，使得卵母细胞恢复成熟分裂。因此创造出一个含有颗粒细胞以及各种生长因子与激素类物质的卵母细胞体外培养体系，能够使我们更加清楚得认识这些物质在IVM过程中所扮演的角色，有助于提高IVM的成功率。三维打印技术是目前科学研究的一个热点。它能够借助计算机图形辅助设计，采用分层加工、叠加成形，能够构建出多样性、复杂三维结构的快速成型技术。近年来该项技术在生物医学多孔材料、组织工程的应用备受重视，尤其是在形态复杂人工骨、可控药物释放模型、多细胞联合打印组织和器官构建等领域具有其独特优势。通过优化控制打印材料及环境条件，活细胞打印、二元细胞乃至多种细胞联合打印和长期共培养均成为现实。在本项研究中，我们拟通过三维打印技术来构建模拟人卵泡的含颗粒细胞的复杂卵母细胞体外培养系统，并通过向其中添加促性腺激素以及其他生长因子来研究IVM的分子机制。这项技术的开发，有助于创造更接近人体真实环境的卵母细胞外微环境，提高IVM的成功率。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种3D生物打印的方法来构建多层次结构人造卵泡，并加入各种细胞生长因子来促进未成熟卵母细胞的成熟，解决现有未成熟卵母细胞促成熟这一IVF上的难题，从而为IVF提供足够的成熟卵母细胞。本专利技术方法包含以下连续步骤:步骤(I)、颗粒细胞的预处理将临床采集分离得到的颗粒细胞首先采用体外培养的方法进行增殖，放入37°C、含体积含量5 % CO2的细胞培养箱培养2?7天，每2天更换培养基一次；取对数生长期的细胞，采用胰蛋白酶消化后制成细胞悬液；所述的胰蛋白酶与对数生长期的细胞的体积比为1:3 ;所述的体外培养采用的培养基为在TCM199培养基中加入体积含量10 %胎牛血清、体积含量0.1 %青霉素-链霉素混合物(其中青霉素-链霉素混合物含有青霉素100U/ml，链霉素 0.lmg/ml)；所述的颗粒细胞是指卵泡中卵母细胞四周围绕着的菱形或扁平的细胞浆中含有颗粒的细胞；步骤(2)、将生物水凝胶与预处理后的颗粒细胞混合均匀，作为3D打印用墨水；其中每mL生物水凝胶加入15?10 7数量的颗粒细胞；所述的生物水凝胶可以但不局限为:海藻酸钠、胶原蛋白、明胶、壳聚糖、透明质酸、层粘联蛋白中的一种；步骤(3)、由于生物水凝胶的选择不同，采用不同的现有成熟凝胶化手段，将3D打印用墨水制成3D打印用凝胶；步骤(4)、采用生物3D打印的方法将步骤(3)得到的3D打印用凝胶打印成具有生产工艺需求形状(如碗形)的产品，即人造卵泡；所述的生物3D打印的方法可以是采用0.5mm 口径的喷嘴将步骤(I)得到的3D打印用墨水按照事先设计好的图形逐层打印，直到形成最终的形状；步骤(5)、在步骤(4)打印完成的产品中加入含体积百分含量多10 %人成熟卵泡液的培养液中，培养24?48h后得到人造颗粒细胞半球；其中所述的培养液为:TCM199培养基，0.075IU/ml FSH(卵泡刺激素)，0.15IU/mlhCG (人绒毛膜促性腺激素)，0.2 μ g/ml的17 β -雌二醇，体积含量10 % FCS (胎牛血清)，体积含量多10 %处理后的人成熟卵泡液；所述的人成熟卵泡液的处理过程是首先将卵泡液离心，5 6 °C灭活，0.2 2 μ m过滤，-20 °C低温保存备用；步骤(6)、在步骤(5)得到的人造颗粒细胞半球中加入未成熟卵母细胞-卵丘颗粒细胞复合体(OCC)，然后采用3D细胞培养的方式培养24?48小时来帮助其成熟，最后得到成熟卵母细胞；所述的未成熟卵母细胞-颗粒细胞复本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用3D打印技术促进人未成熟卵母细胞体外成熟的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：步骤(1)、颗粒细胞的预处理：将临床采集分离得到的颗粒细胞首先采用体外培养的方法进行增殖，放入37℃、含体积含量5﹪CO2的细胞培养箱培养2～7天，每2天更换培养基一次；取对数生长期的细胞，采用胰蛋白酶消化后制成细胞悬液；所述的体外培养采用的培养基为在TCM199培养基中加入体积含量10﹪胎牛血清、体积含量0.1﹪青霉素‑链霉素混合物；步骤(2)、将生物水凝胶与预处理后的颗粒细胞混合均匀，作为3D打印用墨水；其中每mL生物水凝胶加入105～107数量的颗粒细胞；步骤(3)、由于生物水凝胶的选择不同，采用不同成熟凝胶化手段，将3D打印用墨水制成3D打印用凝胶；步骤(4)、采用生物3D打印的方法将步骤(3)得到的3D打印用凝胶打印成具有生产工艺需求形状的产品，即人造卵泡；步骤(5)、在步骤(4)打印完成的产品中加入含体积百分含量≥10﹪人成熟卵泡液的培养液中，培养24～48h后得到人造颗粒细胞半球；其中所述的培养液为：TCM199培养基，0.075IU/ml FSH，0.15IU/ml hCG，0.2μg/ml的17β‑雌二醇，体积含量10﹪FCS，体积含量≥10﹪处理后的人成熟卵泡液；步骤(6)、在步骤(5)得到的人造颗粒细胞半球中加入未成熟卵母细胞‑卵丘颗粒细胞复合体，然后采用3D细胞培养的方式培养24～48小时来帮助其成熟，最后得到成熟卵母细胞。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：金帆，张帆，马梁，全胜，蔡立义，王丽雅，王大辉，姜中石，张诚程，张无忧，王祺婧，
申请(专利权)人：浙江大学，杭州安体科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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