用于卵母细胞的收集及成熟的方法技术

本发明专利技术涉及一种以辅助生殖技术自卵母细胞生产胚胎的方法。该方法包括(a)在包括第一个磷酸二酯酶抑制剂和增加卵母细胞细胞内cAMP浓度的试剂的收集培养基中自受试者卵巢收集卵母细胞；(b)在包括第二个磷酸二酯酶抑制剂的成熟培养基中培养卵母细胞；及(c)以辅助生殖技术自卵母细胞生产胚胎。本发明专利技术还涉及诱导卵母细胞成熟的方法。例如描述了一种包括上面步骤(a)和(b)的卵母细胞体外成熟的方法。本发明专利技术还涉及一种包括磷酸二酯酶抑制剂和用于诱导卵母细胞成熟的配体的卵母细胞成熟培养基。还描述了一种包括上面提到的卵母细胞收集和成熟培养基的组合产物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术一般涉及卵母细胞的收集和成熟的方法。特别是，本专利技术涉及使用改进的收集和成熟培养基的体外方法，该方法能促进卵母细胞在受精前成熟。
技术介绍
在哺乳动物中，未成熟的卵子(卵母细胞)在卵巢内卵泡中生长和发育。未成熟卵母细胞代谢性连接于体颗粒细胞，后者环绕卵母细胞并滋养卵母细胞发育直至排卵。从本质上讲，卵母细胞的成熟取决于其与其同伴体颗粒细胞的关联，体颗粒细胞不仅支持卵母细胞的生长和发育，而且调控减数分裂的进行。在排卵前发展期间卵母细胞的细胞质和核成熟是密切相关但可差异区分的过程， 对于成功受精、胚胎发育、并且可能还对于胚胎植入的能力至关重要，最终影响妊娠结果。在细胞质发育期间，卵母细胞的直径实质上从约15 μ m增加至100 μ m，相当于体积上增加300倍。在此阶段卵母细胞在转录和翻译上均非常活跃。例如，成熟小鼠卵母细胞含有比平均体细胞约200倍多的RNA和约50-60倍多的蛋白质。卵母细胞中的mRNA含量也高，与体细胞中大约2-3%的含量相比，为约15-20%。卵母细胞的核成熟发生在促性腺激素黄体生成素激增之后，并且包含核膜溶解、 染色体浓缩、之后的染色体在赤道板的定位、及纺锤体中微管的组织。在西方国家，现在相当比例的儿童使用辅助生殖技术、包括使用体外受精(IVF) 出生。IVF—般采取以下形式刺激妇女卵巢以产生多个生长卵泡，从这些正准备排卵的生长的大卵泡中收集卵子，体外用精子接触收集的卵子并将产生的胚胎引入至子宫。卵母细胞的体外成熟(IVM)是IVF的辅助疗法，其大大降低了治疗期间投药促性腺激素的需求。 IVM包含从接受低水平促性腺激素或甚至无促性腺激素的患者体内小一些的卵泡中取出卵子。用于获取卵子的过程需要修改的病人管理系统和卵子收取步骤。在标准IVF步骤中所用的大剂量促性腺激素能够导致卵巢过度刺激综合征 (OHSS)的状况，该病征发生于进行IVF周期的约5%的妇女。OHSS通常是温和和自我限制的。在某些情况下，需要紧急医疗救护。在病情严重时，病征能具有潜在的生命危险，需住院治疗、静脉输液、止痛及其他药物治疗。在极少数情况下，可能会发生自腿部血块的肺栓塞或严重脱水的并发症。具有多囊卵巢综合征病征的妇女需要IVM优先于IVF，以避免施用促性腺激素或任意其他卵巢卵泡刺激剂所导致的卵巢过度刺激。IVM也适用于在不孕症治疗期间优先最小化卵泡刺激的妇女。IVM对于患者也更为方便，因为它需要较少的药物施用，通常可由患者自身完成。IVM也有成本优势，因为药物使用的成本被最小化。然而，在实现妊娠和活产方面，IVM相对于IVF的效率降低。尽管近来已有一些对于患者管理的改善，在实验室技术中进展极少。动物胚胎的体外生产(IVP)有许多目的，如家畜和驯化品种的遗传改良、稀有品种的遗传拯救、以及用于操作(如自性精子生产性胚胎、或以体细胞核转移克隆)的平台技术。在体外生产胚胎中的一个重要技术是卵母细胞的体外成熟(IVM)。IVP具有替代当今传统技术，如多发排卵和胚胎移植(MOET)的潜力，其(类似于人类临床应用)需要促性腺激素处理。然而，采用IVP用于育种和其他用途已经为生产可移植阶段胚胎的低效率、此种胚胎胚胎移植之后的不良结果及冻融(储存)此种胚胎之后的不良结果所防碍。因此，培养卵母细胞的新方法和新培养基将是重要的。特别是，用于收集和成熟卵母细胞以改善辅助生殖技术的新方法和新培养基将是特别合乎需要的。在本说明中，任意现有技术的参考不是(且不应被理解为)对于此现有技术形成任意国家内普遍共识的一部分的认可或任何形式的暗示。
技术实现思路
本专利技术起源于卵母细胞体外培养基及其组分的研究，该培养基及组分增进了一旦从卵巢收获的卵母细胞的成熟。一方面，本专利技术提供以辅助生殖技术自卵母细胞生产胚胎的一种方法，该方法包括(a)在包括第一个磷酸二酯酶抑制剂和增加卵母细胞细胞内cAMP浓度的试剂的收集培养基中，自受试者卵巢中收集卵母细胞；(b)在包括第二个磷酸二酯酶抑制剂的成熟培养基中，培养卵母细胞，及(c)以辅助生殖技术自卵母细胞生产胚胎。另一方面，本专利技术提供卵母细胞体外成熟的一种方法，该方法包括(a)在包括第一个磷酸二酯酶抑制剂和增加卵母细胞细胞内cAMP浓度的试剂的收集培养基中，自受试者卵巢收集卵母细胞 ’及(b)在包括第二个磷酸二酯酶抑制剂的成熟培养基中，培养卵母细胞。在另一方面，本专利技术提供一种卵母细胞成熟培养基，该培养基包括(a) 一个磷酸二酯酶抑制剂；及(b)用于诱导卵母细胞成熟的一种配体，其中，在卵母细胞成熟培养基中的配体浓度克服了 cAMP诱导的卵母细胞减数分裂阻滞。在另一方面，本专利技术提供包括下列组分的组合产物(a)包括第一个磷酸二酯酶抑制剂和增加卵母细胞细胞内cAMP浓度试剂的卵母细胞收集培养基 ’及(b)包括第二个磷酸二酯酶抑制剂和用于诱导卵母细胞成熟的配体的卵母细胞成熟培养基；其中，在卵母细胞成熟培养基中的配体浓度克服了 cAMP诱导的卵母细胞减数分裂阻滞。在另一方面，本专利技术提供一种诱导卵母细胞成熟的方法，该方法包括在包括磷酸二酯酶抑制剂和用于诱导卵母细胞成熟的配体的成熟培养基中培养卵母细胞，其中成熟培养基中的配体浓度克服了 cAMP诱导的卵母细胞减数分裂阻滞，因此使卵母细胞成熟。在另一方面，本专利技术提供诱导处于减数分裂阻滞状态卵母细胞成熟的一种方法， 该方法包括以足量浓度的配体接触卵母细胞以克服减数分裂阻滞。专利技术一般说明在此说明书(包括权利要求)中使用术语“包括(comprise) ”、“包括 (comprises) ”、“包括(comprised) ”或“包括(comprising)，，时，它们将被解释为指定所说明的特征、整体、步骤或组分的存在，但不排除一个或多个其他特征、整体、步骤、组分或其群组的存在。如此说明书中所使用的，单数形式“一个”包括复数方面，除非上下文明显另有规定。在表达数值范围时，应清楚地理解此范围涵盖范围上限和下限、及在此限制内的所有数值。本专利技术涉及一种卵母细胞体外收集和成熟的改进方法。已有确切报道，当把收集的卵母细胞放置于包括磷酸二酯酶抑制剂和增加卵母细胞和/或卵母细胞相关卵丘细胞中细胞内cAMP浓度的试剂的收集培养基中、然后在也包括磷酸二酯酶抑制剂的成熟培养基中培养卵母细胞时，显著改善了自多种群(包括人类和牛种群)卵巢中收获的卵母细胞的成熟。关于辅助生殖技术，改进的方法允许卵母细胞受精被推迟直至卵母细胞的成熟更接近于在生殖周期中天然发生的情况(与在已知培养基中收集的卵母细胞的成熟相比)。因此，在本专利技术第一个方面，提供了一种以辅助生殖技术自卵母细胞生产胚胎的方法，该方法包括(a)在包括第一个磷酸二酯酶抑制剂和增加卵母细胞细胞内cAMP浓度的试剂的收集培养基中，自受试者卵巢收集卵母细胞；(b)在包括第二个磷酸二酯酶抑制剂的成熟培养基中，培养卵母细胞，及(c)以辅助生殖技术自卵母细胞生产胚胎。此外，本专利技术第二个方面提供一个卵母细胞体外成熟的方法，该方法包括(a)在包括第一个磷酸二酯酶抑制剂和增加卵母细胞的细胞内cAMP浓度的试剂的收集培养基中，自受试者卵巢收集卵母细胞；(b)在包括第二个磷酸二酯酶抑制剂的成熟培养基中，培养卵母细胞。如上面所讨论的，辅助生殖技术的成功很大程度上取决于受精前卵母本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.05.14 US 61/178,3181.一种以辅助生殖技术自卵母细胞生产胚胎的方法，该方法包括a)在包括第一个磷酸二酯酶抑制剂和增加卵母细胞细胞内cAMP浓度试剂的收集培养基中自受试者卵巢收集卵母细胞；b)在包括第二个磷酸二酯酶抑制剂的成熟培养基中培养卵母细胞；及c)以辅助生殖技术自卵母细胞生产胚胎。2.根据权利要求1所述的方法，其中该试剂增加了卵母细胞细胞内cAMP生产。3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中该试剂是毛喉素。4.根据权利要求1所述的方法，其中该试剂降低了卵母细胞细胞内cAMP降解。5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其中该方法还包括暴露卵母细胞于诱导卵母细胞成熟的配体。6.根据权利要求5所述的方法，其中配体浓度克服了cAMP诱导的卵母细胞减数分裂阻滞。7.根据权利要求5或权利要求6所述的方法，其中该配体是卵泡刺激素(FSH)。8.根据权利要求7所述的方法，其中FSH浓度大于10mIU/ml。9.根据权利要求5至8任一项所述的方法，其中该配体是表皮生长因子(EGF)。10.根据权利要求9所述的方法，其中EGF浓度大于lng/ml。11.根据权利要求1至10任一项所述的方法，其中第一个磷酸二酯酶抑制剂和第二个磷酸二酯酶抑制剂不同。12.根据权利要求1至11任一项所述的方法，其中第一个磷酸二酯酶抑制剂是IBMX。13.根据权利要求1至12任一项所述的方法，其中第二个磷酸二酯酶抑制剂是环己喹酰胺。14.根据权利要求1至10任一项所述的方法，其中第一个磷酸二酯酶抑制剂和第二个磷酸二酯酶抑制剂相同。15.根据权利要求1至14任一项所述的方法，其中辅助生殖技术包括体外受精。16.根据权利要求1至15任一项所述的方法，其中胚胎是人类胚胎。17.根据权利要求16所述的方法，其中体外受精发生在卵母细胞收集后大于M小时。18.根据权利要求1至15任一项所述的方法，其中胚胎是牛胚胎。19.一种体外成熟卵母细胞的方法，该方法包括a)在包括第一个磷酸二酯酶抑制剂和增加卵母细胞细胞内cAMP浓度试剂的收集培养基中自受试者卵巢收集卵母细胞；b)在包括第二个磷酸二酯酶抑制剂的成熟培养基中培养卵母细胞。20.根据权利要求19所述的方法，其中该试剂增加了卵母细胞细胞内cAMP生产。21.根据权利要求19或权利要求20所述的方法，其中该试剂是毛喉素。22.根据权利要求19所述的方法，其中该试剂降低了卵母细胞细胞内cAMP降解。23.根据权利要求19至22的任一项所述的方法，其中该方法还包括暴露卵母细胞于诱导卵母细胞成熟的配体。24.根据权利要求23所述的方法，其中配体浓度克服了cAMP诱导的卵母细胞减数分裂阻滞。25.根据权利要求23或权利要求M所述的方法，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·B·吉克瑞斯特，J·汤普森，F·阿布兹，
申请(专利权)人：阿德莱德研究和创新私人有限公司，
类型：发明
国别省市：