一种合浦珠母贝组织培养方法技术

本发明专利技术涉及一种合浦珠母贝组织培养方法，属于是关于合浦珠母贝组织细胞培养技术。所述方法主要含有（１）组织块取材：将合浦珠母贝表面消毒，在无菌操作台内将闭壳肌割开，取目的组织；（２）消毒和清洗：用纸片将组织表面的粘液沾去，消毒后再将组织转移到组织平衡盐溶液中，清洗表面粘液及残余抗生素；（３）组织培养：将组织块剪成小块，置于组织培养皿中。加入培养基，培养。本发明专利技术适用范围广，灭菌效果较佳，能保护组织细胞免受损伤，组织块培养过程中贴壁效果很好，细胞迁出旺盛，体外存活期较长，易于操作。本发明专利技术所用培养基更适合于海洋贝类组织细胞的培养。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及组织细胞培养技术，具体地说是一种珍珠贝…合浦珠母贝的组织细胞的体外 培养方法。
技术介绍
合浦珠母贝(户/"cto^r/wcatoMartenssi)，又称马氏珠母贝，属于软体动物门(Mollusca)， 瓣鳃纲(Bivalvia)，珍珠贝目(Pterioida)，珍珠贝科(Pteriidae)，珠母贝属(Pinctada)，主 要分布在口本和我国南海，是目前世界上用于海水珍珠生产的主要贝类，其育珠产量占世界 海水珍珠产量的85%以上，也是我国主要的海水珍珠养殖贝。但是，随着贝壳养殖历史的延 长和高密度、集约化、工厂化生产的发展，以及养殖条件环境的日益恶化，养殖病害已成为 全世界，特别是我国海洋贝类生殖生产发展的重要制约因素。近年来，我国养殖的合浦珠母 贝等重要经济贝类发生大规模的爆发性死亡，造成巨大的经济损失。研究合浦珠母贝的组织 培养对于珍珠贝类的疾病控制、改进珠母贝的插核技术、提高珍珠的产量和质量有重要意义。由于无脊椎动物培养条件与哺乳动物有较大差异，所以组织细胞培养较之哺乳动物难度 大。 一方面，合浦珠母贝组织表面有大量的细菌、真菌、原生动物等，组织培养过程中极易 造成污染；另一方面，现有的珍珠贝组织培养技术，存在细胞贴壁效果差、生K:缓慢、迁出 数量较少等缺点。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种适合海洋珍珠贝类的合浦珠母贝组织培养的方法。 为实现上述目标，本专利技术采取的方案包括如下步骤(1) 组织块取材取合浦珠母贝，用吸水纸将贝壳表面吸干，用医用酒精擦拭贝壳表面 消毒，剪去闭壳肌侧的贝壳边缘，在无菌操作台内将闭壳肌割开，取目的组织，将取出的组 织浸润在组织平衡盐溶液中；(2) 消毒和清洗用纸片将组织表面的粘液沾去，将组织放入组织消毒液中浸泡，期间 摇动，再将组织转移到组织平衡盐溶液中，换液，清洗组织表面粘液以及残余的抗生素；(3) 组织培养将绚织块剪成小块，置于预先铺有鼠尾胶原的组织培养皿中，加入培养 基，培养72h后，吸弃0.5ml培养液，补加2ml新鲜的培养液，继续培养。在上述的培养方法，歩骤(1)所述组织平衡盐溶液，其配方是NaCl 26.22 g/L,KCl 1.08 g/L， MgS04 2.94 g/L， MgCl2 2.0 g/L, CaCl2 0.664 g/L, NaHC03 0.3 gZL， NaII2P04 0.044g/L， glucose 0.30 mg/ml， MilliQ水，pH为7.2-7.4，无菌滤膜过滤后使用。在上述的培养方法，步骤(2)所述消毒液，其配方是青霉素100万IU/L，链霉素1 g/L, 庆大霉素80万IU/L,甲硝唑15mg/L，制霉菌素2 mg/L溶解于组织平衡盐溶液中，无菌滤 膜过滤后。在上述的培养方法，步骤(3)所述培养基，其配方是199培养基(Medium 199)和 L-15培养基(Leibovitz-15 medium)粉末分别溶于500 ml灭过菌的MilliQ水中，室温搅拌至 完全溶解，再将两种培养基l: 1混合，加入10.22 g/L NaCl， 40昭/ml抗坏血酸维生素C, 128.9 (ig/ml牛磺酸，10 pg/ml ATP, 400吗/ml乳蛋白水解物，67 mg/ml HEPES，再加入以下抗 生素100IU/ml青霉素，100吗/ml链霉素，50吗/ml卡那霉素和1吗/ml制霉菌素，搅拌， pH调至7.0，无菌条件下过滤，加入10%胎牛血清和10%鸡胚浸液。本专利技术具有如下优点1. 适用范围广，易于操作适用于合浦珠母贝的外套膜、内脏、心肌、腮等各个组织。 设备要求简单，在一般的无菌培养室内就可以完成。2. 灭菌效果较佳，能在一定限度内保护组织细胞免受损伤，又能达到比较理想的灭菌效果由于珠母贝的组织上附生的细菌、真菌和原生动物较多。本专利技术的消毒液的消毒灭菌效果佳，有效降低了组织块染菌的可能性。3. 组织块培养过程中贴壁效果很好，细胞迁出旺盛本方法培养8个小时后既有细胞从组织块中迁出，培养2天后就能形成致密的单层细胞。4. 体外存活期较长 一般在不断补充新鲜培养基的条件下，组织块在90天后仍有细胞迁出。具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术作进一歩详细说明。(1) 组织块取材取合浦珠母贝，用吸水纸将贝壳表面吸千，用医用酒精擦拭贝壳衷面消毒，剪去闭壳肌侧的贝壳边缘。在无菌操作台内用手术刀伸进贝休内将闭壳肌割开，取目 的组织。在收集足够多的组织之前，将取出的组织浸润在组织平衡盐溶液中。(2) 消毒和清洗用灭菌滤纸片将组织表面的粘液沾去。将组织放入组织消毒液中浸泡20 min，间断地摇动，再将组织转移到组织平衡盐溶液中，换液8次，淸洗组织表面粘液以 及残余的抗生素。(3) 组织培养用眼科剪将组织块剪成l-2cmS的小块，置于预先铺有鼠尾胶原的组织 培养皿中，室温放置15-20 min后，让组织块贴附在皿底。加入1.5 ml的培养基，24'C静置 培养，不补充C02。 72h后，吸弃0.5ml培养液，补加2ml新鲜的培养液，继续培养。上述操作均在超净间内的超净台内完成。歩骤(1)所述组织平衡盐溶液，其配方是 NaCl 26.22 g/L, KC1 1.08 g/L, MgS04 2.94 g/L， MgCl2 2.0 g/L, CaCl2 0.664 g/L, NaHC03 0.3 g/L, NaH2P04 0.044g/L， glucose 0.30 mg/ml, MilliQ水，pH为7.2-7.4，无菌滤膜过滤后使用。4步骤(2)所述消毒液，其配方是青霉素100万IU/L，链霉素l g/L，庆大霉素80万 IU/L，甲硝唑15mg/L，制霉菌素2mg/L溶解于组织平衡盐溶液中，无菌滤膜过滤。步骤(3)所述培养基，其配方是199培养基(Medium 199)和L-15培养基(Leibovitz-15 medium)粉末分别溶于500 ml灭过菌的MilliQ水中，室温搅拌溶解3-4 h，再将两种培养基 1:1混合，加入10.22 g/LNaCl，40 (ig/ml抗坏血酸维生素C， 128.9 ng/ml牛磺酸，10昭/ml ATP, 400(ig/ml乳蛋白水解物，67mg/mlHEPES，再加入以下抗生素100IU/ml青霉素，100 |ag/ml 链霉素，50 pg/mi卡那霉素和1 pg/ml制霉菌素，搅拌1 h， pH调至7.0,无菌条件下过滤， 加入胎牛血清和鸡胚浸液。实施例1外套膜组织细胞的培养(1) 外套膜取材取合浦珠母贝，用吸水纸将贝壳表面吸干，用医用酒精擦拭贝壳表面 消毒，剪去闭壳肌侧的贝壳边缘。在无菌操作台内用手术刀伸进贝体内将闭壳肌割开，取外 套膜组织。在收集足够多的组织之前，将取出的组织浸润在组织平衡盐溶液中。(2) 消毒和清洗用灭菌滤纸片将外套膜组织表面的粘液沾去。将外套膜组织放入组织 消毒液中浸泡20min，期间摇动数次，再将外套膜组织转移到组织平衡盐溶液中，换液8次， 清洗外套膜组织表面粘液以及残余的抗生素。(3) 组织培养用眼科剪将外套膜组织块剪成l-2cm3的小块，置于预先铺有鼠尾胶原、 直径为6cm的组织培养皿中，室温放置15-20 min后，让外套膜组织本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种合浦珠母贝组织培养方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：　（１）组织块取材：取合浦珠母贝，用吸水纸将贝壳表面吸干，用医用酒精擦拭贝壳表面消毒，剪去闭壳肌侧的贝壳边缘，在无菌操作台内将闭壳肌割开，取目的组织，将取出的组织浸润在组织 平衡盐溶液中；　（２）消毒和清洗：用纸片将组织表面的粘液沾去，将组织放入组织消毒液中浸泡，再将组织转移到组织平衡盐溶液中，换液，清洗组织表面粘液以及残余的抗生素；　（３）组织培养：将组织块剪成小块，置于预先铺有鼠尾胶原的组织培养 皿中，加入培养基，培养７２ｈ后，吸弃０．５ｍｌ培养液，补加２ｍｌ新鲜的培养液，继续培养。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张荣庆，谢莉萍，李琪，上官俊龙，刘晓军，周玉娟，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]