一种合浦珠母贝大片段DNA的提取方法，包括以下步骤：选取合浦珠母贝闭壳肌组织，粉碎，加入月桂酸钠提取缓冲液、蛋白酶K和RNaseA三种试剂，进行合浦珠母贝闭壳肌组织消化，得消化液；将消化液置于冰上冷却后，加入等体积的酚、氯仿和异戊醇混合液，混匀后，离心，取上清液；在上清液中加入等体积的氯仿和异戊醇混合液，离心，取上清液；在上清液中加入异丙醇，在冰上放置后摇匀至白色沉淀出现完全，静置沉淀，离心，取上清液；在上清液中加入酒精洗涤后离心，除去酒精，所得沉淀物即为合浦珠母贝大片段DNA。该方法能从合浦珠母贝闭壳肌组织中提取到高浓度、大片段的DNA，且该方法简便易行，不耗时，能提高DNA的提取效率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于DNA提取
，具体涉及一种合浦珠母贝大片段DNA的提取方法。
技术介绍
为了全面发掘合浦珠母贝全基因组SNP位点以及为后续更好的完成合浦珠母贝的全基因组选育工作，必须首先要完成全基因组DNA测序工作，随着高通量测序技术的不断完善，全基因组测序（比如GBS）也更为全面和精确，同时测序构建文库对于样本也是有要求的，测序要求DNA浓度要高且完整性要好，也就是要获得大片段DNA。由于合浦珠母贝闭壳肌组织DNA量少，对于现有的传统方法以及试剂盒提取法都不能达到高浓度的DNA，且现在用于合浦珠母贝组织DNA提取的传统方法也较为繁琐，试剂用量不灵活，导致组织DNA的提取量很有限。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种合浦珠母贝大片段DNA的提取方法，该方法能够从合浦珠母贝闭壳肌组织中提取到高浓度、大片段的DNA，可以满足实验需要，而且该方法简便易行，能减少操作时间。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的：一种合浦珠母贝大片段DNA的提取方法，包括以下步骤：（1）选取合浦珠母贝闭壳肌组织，粉碎，加入月桂酸钠提取缓冲液、蛋白酶K和RNase A 三种试剂，进行合浦珠母贝闭壳肌组织消化，得消化液；（2）将消化液置于冰上冷却后，加入等体积的酚、氯仿和异戊醇混合液，混匀后，离心，取上清液；（3）在步骤（2）所得上清液中加入等体积的氯仿和异戊醇混合液，离心，取上清液；（4）在步骤（3）所得上清液中加入异丙醇，在冰上放置后摇匀至白色沉淀出现完全，静置沉淀，离心，取上清液；<br>（5）在步骤（4）所得上清液中加入酒精洗涤后离心，除去酒精，所得沉淀物即为合浦珠母贝大片段DNA。在上述合浦珠母贝大片段DNA的提取方法中：在本专利技术步骤（1）中用到的提取缓冲液是月桂酸钠提取缓冲液，该提取缓冲液pH为8.0，目前很少用于DNA提取中，在贝类组织的DNA提取中还未见报道；月桂酸钠提取缓冲液的配制方法是：准确称取NaCl 5.844g，月桂酸钠 10g，100mL浓度为1mol·L-1的Tris-Hcl、40mL浓度为0.5mol·L-1的EDTA、800mLddH2O，用盐酸调节pH至8.0，定容至1000mL，灭菌后室温保存。步骤（1）中合浦珠母贝闭壳肌组织与月桂酸钠提取缓冲液、蛋白酶K和RNase A 三种试剂的用量关系优选为合浦珠母贝闭壳肌组织50~80mg：月桂酸钠提取缓冲液600~700 μL：蛋白酶K 10μL： RNase A 混合液10μL。步骤（1）中进行合浦珠母贝闭壳肌组织消化时的温度优选为55~56℃，时间为4小时或4小时以上。步骤（2）中酚、氯仿和异戊醇混合液中酚、氯仿和异戊醇的体积比优选为25:24:1；离心时的参数优选为：4℃，11000~13000rpm rpm，离心时间优选为13~17分钟。步骤（3）中氯仿和异戊醇混合液中氯仿和异戊醇的体积比优选为24:1；离心时的参数优选为：4℃，11000~13000rpm rpm，离心时间优选为8~12分钟。步骤（4）中异丙醇的用量优选为步骤（3）所得上清液总体积的1.5倍；在冰上放置时间优选为5分钟，后摇匀至白色沉淀出现完全，离心时的参数优选为：4℃，11000~13000rpm rpm，离心8~12分钟。步骤（5）中在步骤（4）所得上清液中加入酒精优选洗涤2次，酒精的体积百分含量优选为70%。每次洗涤后，离心处理，第一次离心时的参数为4℃，11000~13000rpm rpm，离心时间优选为8~12分钟，较佳为10分钟，第二次离心时的参数为4℃，11000~13000rpm rpm，离心时间优选为5~10分钟，较佳为5分钟。步骤（5）中所得沉淀物即为合浦珠母贝大片段DNA进行电泳时，加入ddH2O，使沉淀物即为合浦珠母贝大片段DNA充分溶解后，再进行电泳。采用本专利技术中的合浦珠母贝大片段DNA的提取方法，获得的DNA浓度能随着样本量和试剂用量成倍上升（下降）而上升（下降），达到试剂与样品用量根据DNA浓度需要而灵活变通；且该方法提取步骤简单易行，不繁琐。总之，根据本专利技术上述方法步骤提取合浦珠母贝DNA，最终能够提取到大片段，浓度高的DNA，从而满足实验需要，而且该方法简便易行，减少了操作时间。作为本专利技术的一种优选的实施方式，本专利技术提供的一种合浦珠母贝大片段DNA的提取方法，包括以下步骤：（1）取50~80mg的合浦珠母贝闭壳肌组织，放入2mL离心管中，剪刀剪碎；（2）加600~700 μL月桂酸钠提取缓冲液，10μL蛋白酶K，10μLRNaseA 混合液在一定温度和时间下进行合浦珠母贝组织消化； （3）取出离心管，静置于冰上，待其冷却，之后加等体积酚（Tris饱和酚）：氯仿：异戊醇，以除去蛋白残留，轻轻缓慢摇匀，放于冰上5分钟左右；（4）拿出离心管，缓慢摇匀几下，4℃，12000rpm，离心15分钟；（5）取出离心管，吸取上清液于新的离心管中，向离心管中加入等体积氯仿：异戊醇（以除去Tris饱和酚），4℃，12000rpm，离心10分钟；（6）取出离心管，吸取上清于另一2mL离心管中，加入1.5倍体积的异丙醇；（7）冰上放置5分钟后缓慢摇匀，待到白色沉淀出现完全，冰上放置5分钟静置沉淀，4℃，12000rpm，离心10分钟；（8）小心取出离心管，吸取上清液，加1-1.5mL 70%酒精洗涤, 4℃，12000rpm，离心10分钟，再次吸取1-1.5mL体积百分含量为70%的酒精洗涤，4℃，12000rpm，离心5分钟；（9）吸取酒精，离心管倒置自然风干，待到白色沉淀变透明后（不能太干，否则影响溶解）加100-200μLddH2O，使白色沉淀充分溶解；(10) 1%琼脂糖凝胶电泳。在该优选的实施方式中：在本专利技术中用到的提取缓冲液是月桂酸钠提取缓冲液，该提取缓冲液，pH为8.0，目前很少用于DNA提取中，在贝类组织的DNA提取中还未见报道；月桂酸钠提取缓冲液的配制方法是：准确称取NaCl 5.844g，月桂酸钠 10g置于1000mL烧杯中，加入100ml Tris-Hcl（1M）以及40mLEDTA（0.5M）、800mlddH2O，用盐酸调节pH至8.0，定容至1000mL，灭菌后室温保存。在本专利技术中蛋白酶K，月桂酸钠，RNaseA混合消化合浦珠母贝组织DNA的消化温度为55~56℃，消化时间为4小时或以上。在本专利技术中酚：氯仿：异戊醇的比例为25：24：1，氯仿：异戊醇的比例为24：1。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：（1）本专利技术合浦珠母贝组织大片段DNA提取方法中所用的提取缓冲液是月桂酸钠提取缓冲液（也叫裂解液），裂解效果不亚于现有组织裂解液，而且此裂解液在动物组织DNA提取中从未有报道，是一种新型裂解液；（2）与现有合浦珠母贝组织DNA提取方法相比，本专利技术方法步骤简单，缩短了合浦珠母贝DNA提取时间，用到的试剂种类本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种合浦珠母贝大片段DNA的提取方法，其特征是包括以下步骤：（1）选取合浦珠母贝闭壳肌组织，粉碎，加入月桂酸钠提取缓冲液、蛋白酶K和RNase A三种试剂进行合浦珠母贝闭壳肌组织消化，得消化液；（2）将消化液置于冰上冷却后，加入等体积的酚、氯仿和异戊醇混合液，混匀后，离心，取上清液；（3）在步骤（2）所得上清液中加入等体积的氯仿和异戊醇混合液，离心，取上清液；（4）在步骤（3）所得上清液中加入异丙醇，在冰上放置后摇匀至白色沉淀出现完全，静置沉淀，离心，取上清液；（5）在步骤（4）所得上清液中加入酒精洗涤后离心，除去酒精，所得沉淀物即为合浦珠母贝大片段DNA。
【技术特征摘要】
1.一种合浦珠母贝大片段DNA的提取方法，其特征是包括以下步骤：
（1）选取合浦珠母贝闭壳肌组织，粉碎，加入月桂酸钠提取缓冲液、蛋白酶K和RNase A三种试剂进行合浦珠母贝闭壳肌组织消化，得消化液；
（2）将消化液置于冰上冷却后，加入等体积的酚、氯仿和异戊醇混合液，混匀后，离心，取上清液；
（3）在步骤（2）所得上清液中加入等体积的氯仿和异戊醇混合液，离心，取上清液；
（4）在步骤（3）所得上清液中加入异丙醇，在冰上放置后摇匀至白色沉淀出现完全，静置沉淀，离心，取上清液；
（5）在步骤（4）所得上清液中加入酒精洗涤后离心，除去酒精，所得沉淀物即为合浦珠母贝大片段DNA。
2.根据权利要求1所述的合浦珠母贝大片段DNA的提取方法，其特征是：步骤（1）中月桂酸钠提取缓冲液的配制方法是：准确称取NaCl 5.844g，月桂酸钠 10g，100mL浓度为1mol·L-1的Tris-Hcl、40mL浓度为0.5mol·L-1的EDTA、800mLddH2O，用盐酸调节pH至8.0，定容至1000mL，灭菌后室温保存。
3.根据权利要求1所述的合浦珠母贝大片段DNA的提取方法，其特征是：步骤（1）中合浦珠母贝闭壳肌组织与月桂酸钠提取缓冲液、蛋白酶K和RNaseA 三种试剂的用量关系为合浦珠母贝闭壳肌组织50~80mg：月桂酸钠提取缓冲液600~700 μL：蛋白酶K 10μL： RNase A 10μL。
4.根据权利要求1所述的合浦珠母贝大片段DNA的提取方法，其特征是：步骤（1）中进行合浦珠母贝闭壳肌组织消化时的温度为55~56℃，时间为4...
【专利技术属性】
技术研发人员：邱萤，喻达辉，张东玲，黄桂菊，范嗣刚，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院南海水产研究所，集美大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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