合浦珠母贝外套膜外上皮细胞的分离方法技术

本发明专利技术涉及合浦珠母贝外套膜外上皮细胞的分离方法，属于组织细胞培养分离技术领域。主要包括以下几个步骤：（１）配制Ｐｅｒｃｏｌｌ梯度溶液：将９份Ｐｅｒｃｏｌｌ原液与１份Ｄ－ＭＢＳＳ混合，得到１００％Ｐｅｒｃｏｌｌ溶液；将１００％Ｐｅｒｃｏｌｌ原液与Ｄ－ＭＢＳＳ溶液以不同比例混合，得到Ｐｅｒｃｏｌｌ梯度液；（２）制备梯度层：预先用ＢＳＡ溶液浸泡离心管管壁，然后制备梯度管。（３）加入细胞悬液：将待分离细胞悬液加入到梯度管中。（４）细胞分离：离心后，取出细胞，洗涤，重悬。本发明专利技术能从原代培养的组织块中迁出的细胞中分离出单一类型的细胞群，对细胞损伤较小，能最大限度地保持细胞的活力，分离后的细胞还能继续培养，易于操作。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及组织细胞培养分离技术，具体地说是从一种珍珠贝——合浦珠母贝原代培养 的组织块迁出细胞中分离单一类型细胞的技术。
技术介绍
合浦珠母贝(/^cto由/wcaf"MartenssO，又称马氏珠母贝，属于软体动物门(Mollusca)， 瓣鳃纲(Bivalvia)，珍珠贝目(Pterioida)，珍珠贝科(Pteriidae)，珠母贝属(Pinctada)，主 要分布在我国沿海，是目前世界上用于海水珍珠生产的主要贝类。近年来，由于全球气候变 化的影响，以及养殖贝类经济目的导致珍珠贝的质量和珍珠的品质下降。进行合浦珠母贝组 织细胞的培养及其分离对珍珠贝的质量和珍珠的品质有重要意义。由于合浦珠母贝原代细胞培养过程中迁出的细胞较多，不利于细胞的分离培养和单一细 胞群性质的分析。目前，对合浦珠母贝组织细胞分离纯化的研究非常少，相关技术比较薄弱。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种从合浦珠母贝原代培养的组织块迁出细胞中分离单一类型细胞的方法。本专利技术提出的，其特征在于，所述方法含有以下步骤(1) 配制细胞分离液梯度溶液在离心管中，将9份细胞分离液原液与1份无钙镁离子 的组织清洗液混合，得到100%细胞分离液溶液；将100%细胞分离液溶液与无钙镁离子的组 织清洗液溶液以不同比例混合，制备所需的不同浓度和不同体积的细胞分离液梯度液；(2) 制备梯度层取离心管，预先用牛血清白蛋白溶液浸泡管壁，倾去牛血清白蛋白溶 液，加入上述细胞分离液梯度液制备梯度管；将浓度渐减的细胞分离液梯度液从离心管底部 轻轻地逐层铺；(3) 加入细胞悬液用毛细管将待分离细胞悬液铺至梯度管中最轻地细胞分离液溶液之上；(4) 细胞分离离心后取出离心管，将各梯度层之间界面上的细胞分部收集于离心管中， 加入无钙镁离子的组织清洗液溶液，离心，弃上清，加入无钙镁离子的组织清洗液溶液洗涤， 重新悬浮后计数细胞。在上述的分离方法中，步骤(1)和(4)所述无钙镁离子的组织清洗液溶液，其配方是: NaCl 26.22 g/L, KC1 1.08 g/L,, NaHC03 0.35g/L， Na2HP04 0.09g/L， KH2P04 0.06g/L, MilliQ水， 调整PH为7.2-7.4，无菌过滤后使用。在上述的分离方法中，步骤(2)所述牛血清白蛋白溶液，其配方是将牛血清白蛋白加 入到100毫升磷酸盐缓冲(PBS)溶液中，待充分溶解后使用。本专利技术有如下优点-1. 本专利技术能从原代培养的组织块中迁出的细胞中分离出单一类型的细胞群。在一定得梯 度层内能得到单一类型细胞，可以避免细胞碎片以及较大的细胞混合团的污染。2. 对细胞损伤较小，能最大限度地保持细胞的活力，分离后的细胞还能继续培养。分离 后的细胞可以进行生理生化等后续研究。3. 易于操作。无需特殊设备，成本较低。具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术作进一步详细说明。 实施例:外套膜外上皮细胞细胞分离(1) 配制Percoll梯度溶液在离心管中，将9份Percoll原液与1份D-MBSS混合，即得 到100%Percoll溶液。将100%Percoll原液与D-MBSS溶液以不同比例混合，配制15%、 30%、 36%的Percoll梯度液。(2) 制备梯度层取离心管，预先用1MBSA溶液浸泡管壁一段时间，倾去BSA溶液，有 注射器由下至上加入上述36%、 30%、 15%的Percoll梯度液制备梯度管。(3) 加入细胞悬液用毛细管将2ml待分离细胞悬液(含约5><107个细胞)轻轻铺至梯度 管中15%的Percoll溶液之上，在室温下以1000 rpm/min离心5 min，继续以2000 rpm/min离心15 min。(4) 细胞分离取出离心管，用毛细吸管将36%和30%界面上的细胞收集于离心管中，加 入3倍体积的D-MBSS溶液，1500 rpm/min离心10 min，弃上清，加入D-MBSS溶液 洗涤2次，重新悬浮后计数细胞。(5) 进行细胞鉴定或者其他研究。.权利要求1、，其特征在于，所述方法含有以下步骤(1)配制细胞分离液梯度溶液在离心管中，将9份细胞分离液原液与1份无钙镁离子的组织清洗液混合，得到100％细胞分离液溶液；将100％细胞分离液溶液与无钙镁离子的组织清洗液溶液以不同比例混合，制备所需的不同浓度和不同体积的细胞分离液梯度液；(2)制备梯度层取离心管，预先用牛血清白蛋白溶液浸泡管壁，倾去牛血清白蛋白溶液，加入上述细胞分离液梯度液制备梯度管；将浓度渐减的细胞分离液梯度液从离心管底部轻轻地逐层铺；(3)加入细胞悬液用毛细管将待分离细胞悬液铺至梯度管中最轻地细胞分离液溶液之上；(4)细胞分离离心后取出离心管，将各梯度层之间界面上的细胞分部收集于离心管中，加入无钙镁离子的组织清洗液溶液，离心，弃上清，加入无钙镁离子的组织清洗液溶液洗涤，重新悬浮后计数细胞。2、 按照权利要求1所述的分离方法，其特征在于步骤(1)和(4)所述无钙镁离子的 组织清洗液溶液，其配方是NaCl 26.22 g/L, KC11.08 g/L,, NaHC03 0.35g/L， Na2HP04 0.09g/L, KH2P04 0.06g/L， MilliQ水，调整pH为7.2-7.4，无菌过滤后使用。3、 按照权利要求1所述分离方法，其特征在于步骤(2)所述牛血清白蛋白溶液，其 配方是将牛血清白蛋白加入到100毫升磷酸盐缓冲(PBS)溶液中，待充分溶解后使用。全文摘要本专利技术涉及，属于组织细胞培养分离
主要包括以下几个步骤(1)配制Percoll梯度溶液将9份Percoll原液与1份D-MBSS混合，得到100％Percoll溶液；将100％Percoll原液与D-MBSS溶液以不同比例混合，得到Percoll梯度液；(2)制备梯度层预先用BSA溶液浸泡离心管管壁，然后制备梯度管。(3)加入细胞悬液将待分离细胞悬液加入到梯度管中。(4)细胞分离离心后，取出细胞，洗涤，重悬。本专利技术能从原代培养的组织块中迁出的细胞中分离出单一类型的细胞群，对细胞损伤较小，能最大限度地保持细胞的活力，分离后的细胞还能继续培养，易于操作。文档编号C12N5/06GK101608173SQ20091008769公开日2009年12月23日 申请日期2009年7月3日 优先权日2009年7月3日专利技术者上官俊龙, 刘晓军, 周玉娟, 张荣庆, 琪 李, 谢莉萍 申请人:清华大学本文档来自技高网...

【技术保护点】
合浦珠母贝外套膜外上皮细胞的分离方法，其特征在于，所述方法含有以下步骤：　（１）配制细胞分离液梯度溶液：在离心管中，将９份细胞分离液原液与１份无钙镁离子的组织清洗液混合，得到１００％细胞分离液溶液；将１００％细胞分离液溶液与无钙镁离子 的组织清洗液溶液以不同比例混合，制备所需的不同浓度和不同体积的细胞分离液梯度液；　（２）制备梯度层：取离心管，预先用牛血清白蛋白溶液浸泡管壁，倾去牛血清白蛋白溶液，加入上述细胞分离液梯度液制备梯度管；将浓度渐减的细胞分离液梯度液从离心 管底部轻轻地逐层铺；　（３）加入细胞悬液：用毛细管将待分离细胞悬液铺至梯度管中最轻地细胞分离液溶液之上；　（４）细胞分离：离心后取出离心管，将各梯度层之间界面上的细胞分部收集于离心管中，加入无钙镁离子的组织清洗液溶液，离心，弃上 清，加入无钙镁离子的组织清洗液溶液洗涤，重新悬浮后计数细胞。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张荣庆，谢莉萍，上官俊龙，李琪，刘晓军，周玉娟，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]