本发明专利技术涉及制备利用人羊膜间充质细胞治疗缺血性脑损伤注射液的方法及其注射液，它包括：将人羊膜组织分离成单个人羊膜间充质细胞；将人羊膜间充质细胞扩增2-3代到所需的数目后，在-196℃至-185℃的液氮下将上述人羊膜间充质细胞冷冻；在需要配制注射液之前，将上述的冷冻人羊膜间充质细胞复苏；将人羊膜间充质细胞扩增3-5代到所需的数目后，将上述人羊膜间充质细胞放入生理盐水中，每毫升生理盐水中含有105个至106个活的人羊膜间充质细胞。
Method for preparing injection of human amnion mesenchymal cell for treating ischemic brain damage and its injection
The invention relates to a preparation method of using human amniotic mesenchymal cells between injection in treating ischemic brain injury and injection, it includes: the isolation of human amniotic tissue into single amniotic mesenchymal cells; human amniotic mesenchymal cells amplified 2-3 generation to the number of required, at -196 DEG to -185 DEG C in liquid nitrogen will the human amniotic mesenchymal cells cryopreservation; before the preparation of injection, frozen human amniotic mesenchymal cells; human amniotic mesenchymal cells amplified 3-5 generation to the number of required after the human amniotic mesenchymal cells into normal saline, containing 105 to 106 a living human amniotic mesenchymal cells per milliliter of saline.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及了一种治疗缺血性脑损伤注射液的方法及其注射液，特别是制备利用 人羊膜间充质细胞治疗缺血性脑损伤注射液的方法及其注射液。
技术介绍
干细胞(Stem cell, SC)是一类具有自我更新(self-renewing)和多向分化潜能 的细胞，在一定的条件下，可以分化成多种功能的细胞或组织器官，医学界称之为“万用细 胞”。间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是SC中的一类，它来源于发育早期 中胚层，广泛存在于骨髓、骨膜、脂肪、羊水、真皮、牙、骨骼肌、胎肺、胎肝、脐血、脐带等多种 组织中，同样具有自我更新，高度增殖和多向分化潜能。目前人羊膜间充质细胞(MSCs)已 成为干细胞研究领域的热点，被广泛应用于各系统疾病的治疗研究。中枢神经系统损伤后 的神经修复与再生一直是神经科学研究领域的重点和难点。这是因为中枢神经系统缺乏其 它系统的器官组织强大的自我修复能力，绝大多数神经元受损后不能再生，再生的细胞也 不能建立正常的树突和轴突联系，从而造成不同程度的神经功能障碍，影响中枢神经系统 的各种调节功能。近年来，随着医学的快速发展和干细胞研究的不断深入，基因治疗、移植 免疫学和发育生物学等学科间相互渗透与促进，干细胞在神经系统损伤中的修复作用越来 越备受关注。由于羊膜是来源于胎儿的产物，暴露于母体免疫系统监视下，其表面人类白细胞 抗原(HLA)-A、B、C低表达，不表达HLA-DR，提示羊膜移植不引发免疫排斥。间充质干细胞 是低免疫原性细胞，不引发异常淋巴细胞增殖反应，并且能通过抑制T细胞、B细胞和NK细 胞功能，影响树突状细胞活性，此外还可以产生各种生长因子、细胞因子、趋化因子和蛋白 酶来调节免疫反应和改变组织微环境，刺激内源性干细胞减轻免疫炎症反应。人羊膜间充 质细胞低表达MHC-I，不表达MHC-II，可以避免免疫排斥反应，SUSANNE等对同一条件下人 羊膜间充质细胞、人羊膜上皮细胞与脂肪组织来源的干细胞的免疫调节活性进行比较，发 现羊膜来源的间充质干细胞和上皮干细胞免疫抑制作用的发挥依赖于细胞接触和细胞剂 量。血管内皮细胞是组织工程化血管的核心，是血管外科和心脏外科血管移植物的 主要材料。目前研究利用各种间充质细胞进行诱导分化取得了很大进展。Joachim等采 用密度梯度法分离人MSCs，加入2%胎牛血清和50 μ g/L血管内皮生长因子(vascula r endothelialgrowth factor, VEGF)诱导7d，发现诱导前后细胞没有明显的形态学改变，但 免疫组织化学提示VIII因子抗体有显著的升高，电镜可以发现Weibel-Palade小体(W_P 小体)。同时，细胞表达CD44、CD73、CD90、CD105、CD166、VFGF受体KDR/F1121、血管内皮黏 附分子及血管细胞黏附分子。在半固体培养基中还可以形成血管腔样结构。诱导后的细胞 呈梭形，传代超过5代后细胞即变宽、变平，故有关内皮细胞的研究应在第1 5代之间进 行。Liang等应用VEGF和碱性成纤维生长因子诱导后发现，细胞形成血管腔样结构，周围有呈铺路石样排列的内皮样细胞。兔抗VEGF受体l(Flt21)最早阳性表达，随后⑶34、⑶31、 Flt21、VIII因子抗体也阳性表达并呈逐渐增加的趋势。Gang等则提取脐血MSCs经VEGF、 表皮生长因子和皮质醇激素诱导3周，同样诱导出具有内皮细胞表面标记的细胞，并发现 有一些细胞因子分泌。脑血管疾病(cerebralvasculardiseases，CVD)为临床常见病之一。2005 年 9 月出版的《新英格兰杂志》发表了中国医学科学院最新的流行病学调查脑血管病是40岁 以上中国人口总体死亡的第三位原因，是女性死亡的第二位因，是男性死亡的第三位原因； 脑血管病患者总体年死亡率为276. 9/10万，女性年死亡率为M2. 3/10万，男性年死亡率为 310. 5/10万。调查显示脑血管疾病是所有血管性疾病致死的首位原因。按照这个最新统计 结果，我国每年死于脑血管病的总人数近300万之多，同时每年还有近200万例新发脑卒中 病例。患病后的幸存者有3/4不同程度地丧失劳动能力，给社会和家庭带来极大的精神痛 苦和经济负担。在全部脑血管病中缺血性脑血管(isehemiccerebralvaseular disease, I⑶)在我国占到70%左右，在欧美国家比例则达85%之高。因此重视和解决I⑶的问题对 整个社会脑血管病的治疗具有极其重要的意义。近年来，尽管ICD的发病年龄有年轻化的 趋势，但是发病群体的主体还是老年人。按照目前国际通用的标准，中国已经成为人口老年 型国家。人口普查资料显示中国60岁及65岁以上老年人口占总人口的比例分别超过了 7%与10% ,2030-2040年前后60岁以上老年人1 3将占总人口的20%以上。如何在一 个老龄化比重较高的社会里更好地保障人民健康水平，提高ICD患者的生活质量是我国卫 生事业面临的巨大课题。治疗ICD目前除了发病急性期6小时内的溶栓治疗，尚没有更为 有效的治疗措施，上个世纪末期，国内外学者在干细胞治疗缺血性脑卒中的基础和临床研 究方面取得了一定的研究成果，因此为广大的缺血性脑卒中患者带来了希望的曙光。人羊膜间充质细胞作为一种多潜能细胞，由于间充质干细胞在体内所定居的组织 不同，微环境中的细胞因子、生长因子等各种调控物质不同，可促进间充质干细胞向不同的 谱系分化。人羊膜间充质细胞可以分化成神经元和血管内皮细胞，在植入缺血性脑损伤部 位后，它分化成神经元和血管内皮细胞，可以有效地治疗缺血性脑损伤，减少由于缺血性脑 损伤而造成的死亡并且使缺血性脑损伤的患者尽快恢复。
技术实现思路
本申请的专利技术目的在提供一种制备利用人羊膜间充质细胞治疗缺血性脑损伤注 射液的方法及其注射液。为了完成本申请的专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案本专利技术的一种制备利用人羊膜间充质细胞治疗缺血性脑损伤注射液的方法，其 中它包括以下步骤(1)将人羊膜组织分离成单个人羊膜间充质细胞；(2)将人羊膜间充质细胞扩增2-3代到所需的数目后，加入DMEM/F12得到含有人 羊膜间充质细胞的悬浊液，使人羊膜间充质细胞的个数为1 X IO6个/毫升-2 X IO6个/毫 升；(3)将上述人羊膜间充质细胞在_196°C至_185°C的液氮下冷冻保存；(4)在需要配制注射液之前，将上述的冷冻人羊膜间充质细胞复苏；(5)将人羊膜间充质细胞扩增3-5代到所需的数目后，加入DMEM/F12得到含有人 羊膜间充质细胞的悬浊液，使人羊膜间充质细胞的个数为1 X IO7个/毫升-2 X IO7个/毫 升；(6)将上述人羊膜间充质细胞放入生理盐水中，每毫升生理盐水中含有IO5个至 IO6个活的人羊膜间充质细胞；本专利技术的一种制备利用人羊膜间充质细胞治疗缺血性脑损伤注射液的方法，其 中所述的步骤C3)包括将在培养瓶底部融合85%以上的人羊膜间充细胞，用D-hank’ s 过洗2次，然后加入2毫升0. 25%胰蛋白酶，待细胞60-70%缩小变圆之后，加2毫升含有蛋 白酶抑制剂的终止液，回收细胞悬液，在室温下将其放入离心机中以1500r/min的转速离 心5本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种制备利用人羊膜间充质细胞治疗缺血性脑损伤注射液的方法及其注射液，其特征在于：它包括以下步骤：（１）将人羊膜组织分离成单个人羊膜间充质细胞；（２）将人羊膜间充质细胞扩增２－３代到所需的数目后，加入ＤＭＥＭ／Ｆ１２得到含有人羊膜间充质细胞的悬浊液，使人羊膜间充质细胞的个数为１×１０６个／毫升－２×１０６个／毫升；（３）将上述人羊膜间充质细胞在－１９６℃至－１８５℃的液氮下冷冻保存；（４）在需要配制注射液之前，将上述的冷冻人羊膜间充质细胞复苏；（５）将人羊膜间充质细胞扩增３－５代到所需的数目后，加入ＤＭＥＭ／Ｆ１２得到含有人羊膜间充质细胞的悬浊液，使人羊膜间充质细胞的个数为１×１０７个／毫升－２×１０７个／毫升；（６）将上述人羊膜间充质细胞放入生理盐水中，每毫升生理盐水中含有１０５个至１０６个活的人羊膜间充质细胞。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李荣旗，郭丽丽，刘佳新，
申请(专利权)人：李荣旗，郭丽丽，刘佳新，
类型：发明
国别省市：11
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