ＴＯＰ２Ａ　ｍＲＮＡ表达水平检测液相芯片和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种ＴＯＰ２Ａ？ｍＲＮＡ表达水平检测液相芯片，所述检测液相芯片，主要包括有：与胺基修饰的支持探针偶联的微球；连接支持探针与目标基因ｍＲＮＡ的支持延伸探针，每条支持延伸探针包括５’端能与对应的目标基因ｍＲＮＡ结合的特异性序列、间隔臂序列、３’端的能与对应的支持探针的特异性序列互补配对的序列；连接目标基因ｍＲＮＡ与信号检测组分间的扩增延伸探针，每条扩增延伸探针包括５’端能与目标基因ｍＲＮＡ结合的特异性序列、间隔臂序列、３’端能与标记探针互补配对的序列。本发明专利技术还公开了运用该液相芯片对ＴＯＰ２Ａ？ｍＲＮＡ表达水平检测的方法。本发明专利技术检测过程无需ＲＮＡ提取、逆转录、ＰＣＲ等步骤，检测结果受样本中ＲＮＡ的质量影响较小，保证了检测结果的准确性；另一方面，由于液相芯片技术使多指标并行检测成为了现实，在一次检测中可设置多个内参基因，使检测结果更为可靠。

TOP2A mRNA expression level detection liquid chip and detection method

The invention discloses a TOP2A? The expression level of mRNA detection liquid phase chip, the detection of liquid chip, mainly include: support probe coupling and amine modified microspheres; connecting support probe and the target gene mRNA support extension probes, each probe includes a support extension 5 'end can bind to the target gene mRNA corresponding to the specific sequence, interval arm sequence, 3' end of the specific sequence and support probe corresponding to the complementary sequence; connecting the mRNA with the signal of the target gene amplification component extension probes, each probe amplification extension comprises 5 'end can bind to the target gene mRNA specific sequence, spacer sequence, 3' end with the tag sequence complementary probe. The present invention also discloses the use of the liquid phase chip for TOP2A Method for detecting expression level of mRNA. The detection process without RNA extraction, reverse transcription, PCR and other steps, the detection results affected by the quality of RNA in small sample, ensure the accuracy of test results; on the other hand, because the liquid chip technology makes the multi index parallel detection has become a reality, in a test set a number of reference genes, the the detection result is more reliable.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及TOP2A mRNA表达检测液相芯片及检测方法。
技术介绍
DNA拓扑酶II(Topo II)抑制剂药物是一类重要的化疗药物，主要有依托泊苷(etoposide)、开普拓、鬼臼噻吩苷、拓扑特肯等，其中，依托泊苷作为细胞周期特异性抗肿瘤Topo II抑制剂药物，主要用于治疗小细胞肺癌、恶性淋巴瘤、恶性生殖细胞瘤、白血病，对神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、卵巢癌、非小细胞及小细胞肺癌、胃癌和食管癌等有一定疗效。其抗癌机制是作用于DNA拓扑异构酶，形成药物-酶-DNA稳定的可逆性复合物，阻碍DNA修复。DNA拓扑异构酶II是一种真核生物生存所必需的泛酶，在几乎所有DNA代谢过程中发挥重要作用。Topo II有IIα型和IIβ型两种，其中Topo IIα(又称TOP2A)在细胞快速增殖期含量最高，对多种肿瘤细胞系Topo IIαmRNA检测表明，Topo IIα在各种肿瘤组织广泛表达，无明显组织特异性。Topo II介导DNA解结或解旋，在DNA代谢的细胞生命过程中起重要作用。因为其重要生理功能，Topo II已成为抗癌药物的重要作用靶点。Topo II抑制剂通过直接作用Topo II或仅与双链DNA中的一条链结合以影响Topo II功能。研究表明Topo IIα酶活性的降低或表达水平降低都会造成Topo II抑制剂药物耐药。研究报道高表达的Topo IIα使用依托泊苷效果较好，低表达的Topo IIα对依托泊苷药物耐药。检测TOP2AmRNA表达水平可以有效预测化疗药物依托泊苷的疗效。 作为TOP2A表达水平的参照物，持家基因一般在体内可稳定表达，但由于这种稳定表达是相对的，在一定的病理状态或用药情况下，某些常用的持家基因的表达也会发生变化。选择在我们所研究对象中稳定表达的基因作持家基因，对保证检测结果的准确性至关重要。因此，本专利技术从一定数量的常用持家基因中进行筛选，确定3个合适的持家基因，分别是β2-微球蛋白(B2M)、铁传递蛋白受体(TFRC)、TATA框结合蛋白(TBP)。 基于以上基因的表达水平与化疗药物疗效的相关性，专家推荐患者在接受化疗药物之前，应当进行相关的基因mRNA表达水平的检测，帮助临床医生根据患者的个体差异制定个体化用药方案，以提高药物疗效，减少药物毒副作用的发生。 目前，对基因的mRNA表达水平进行检测的技术主要有逆转录定量PCR法、实时荧光定量PCR法、RNA原位核酸杂交(RISH)等。其中，RISH主要用于分析组织或细胞内RNA分布以了解特定基因的表达情况，且其过程较长、操作繁琐，不适合用于临床应用；而逆转录定量PCR法与实时荧光定量PCR法，首先，这两种方法均需要进行RNA抽提、逆转录，检测的结果受RNA降解影响大；其次，这两种方法只通过一对引物进行PCR扩增，容易产生非特异性结合，从而导致假阳性高；再次，这两种方法一般只有一个持家基因作对照，其准确性容易受到病理状态的影响；因此，逆转录定量PCR法与实时荧光定量PCR法作为临床应用均存在着难以克服的技术缺陷。 液相芯片技术利用聚苯乙烯微球作为反应的载体，在微球的制造过程中，掺入不同比例的染色剂，从而形成100种不同颜色编码的微球。不同的微球共价结合了针对不同待检测物的探针分子从而实现对多达100中待检物质的同步并行检测。因此，我们采用液相芯片技术可以同时检测多个基因的mRNA表达水平，实现了检测的高通量，大大提高了检测效率。 技术方案 本专利技术的目的之一是提供检测TOP2A mRNA表达水平的液相检测芯片。 实现上述目的的技术方案如下 一种TOP2A mRNA表达水平检测液相芯片，主要包括有 (1)与胺基修饰的支持探针偶联的微球，每条支持探针主要包括5’端的间隔臂序列和3’端的与支持延伸探针互补配对的特异性序列P1，所述支持探针选自SEQ.NO.1-SEQ.NO.4，每个目标基因选用一种微球，每种微球具有不同的荧光编码； (2)连接支持探针与目标基因mRNA的支持延伸探针，每条支持延伸探针包括5’端能与对应的目标基因mRNA结合的特异性序列P2、间隔臂序列、3’端能与对应的支持探针的特异性序列P1互补配对的P3序列，所述支持延伸探针的特异性序列P2包括有针对TOP2A基因的选自SEQ.NO.5-SEQ.NO.10中的2条或2条以上；针对B2M基因的选自SEQ.NO.11-SEQ.NO.15中的2条或2条以上，针对TFRC基因的选自SEQ.NO.16-SEQ.NO.20中的2条或2条以上，和针对TBP基因的选自SEQ.NO.21-SEQ.NO.25中的2条或2条以上；所述支持延伸探针的P3序列选自SEQ.NO.26-SEQ.NO.29； (3)扩增延伸探针，每条扩增延伸探针包括5’端能与目标基因mRNA结合的特异性序列P4、间隔臂序列、3’端序列P5，3’端还修饰有生物素；所述扩增延伸探针的特异性序列P4包括有针对TOP2A基因的选自SEQ.NO.30-SEQ.NO.39中的5条或5条以上；针对B2M基因的选自SEQ.NO.40-SEQ.NO.49中的5条或5条以上，针对TFRC基因的选自SEQ.NO.50-SEQ.NO.59中的5条或5条以上，和针对TBP基因的选自SEQ.NO.60-SEQ.NO.69中的5条或5条以上；所述P5为不存在内部发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3、P4和总mRNA之间均不存在非特异性结合的序列。 或一种TOP2A mRNA表达水平检测液相芯片，主要包括有 (1)与胺基修饰的支持探针偶联的微球，每条支持探针主要包括5’端的间隔臂序列和3’端的与支持延伸探针互补配对的特异性序列P1，所述支持探针选自SEQ.NO.1-SEQ.NO.4，每个目标基因选用一种微球，每种微球具有不同的荧光编码； (2)连接支持探针与目标基因mRNA的支持延伸探针，每条支持延伸探针包括5’端能与对应的目标基因mRNA结合的特异性序列P2、间隔臂序列、3’端能与对应的支持探针的特异性序列P1互补配对的P3序列，所述支持延伸探针的特异性序列P2包括有针对TOP2A基因的选自SEQ.NO.5-SEQ.NO.10中的2条或2条以上；针对B2M基因的选自SEQ.NO.11-SEQ.NO.15中的2条或2条以上，针对TFRC基因的选自SEQ.NO.16-SEQ.NO.20中的2条或2条以上，和针对TBP基因的选自SEQ.NO.21-SEQ.NO.25中的2条或2条以上；所述支持延伸探针的P3序列选自SEQ.NO.26-SEQ.NO.29； (3)扩增延伸探针，每条扩增延伸探针包括5’端能与目标基因mRNA结合的特异性序列P4、间隔臂序列、3’端序列P5；所述扩增延伸探针的特异性序列P4包括有针对TOP2A基因的选自SEQ.NO.30-SEQ.NO.39中的5条或5条以上；针对B2M基因的选自SEQ.NO.40-SEQ.NO.49中的5条或5条以上，针对TFRC基因的选自SEQ.NO.50-SEQ.NO.59中的5条或5条以上，和针对TBP基因的选自SEQ.NO.60-SEQ.NO.69中的5条本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＴＯＰ２Ａ　　ｍＲＮＡ表达水平检测液相芯片，其特征是，主要包括有：　　　　（１）与胺基修饰的支持探针偶联的微球，每条支持探针主要包括５’端的间隔臂序列和３’端的与支持延伸探针互补配对的特异性序列Ｐ１，所述支持探针选自ＳＥＱ．ＮＯ．１－ＳＥＱ．ＮＯ．４，每个目标基因选用一种微球，每种微球具有不同的荧光编码；　　　　（２）连接支持探针与目标基因ｍＲＮＡ的支持延伸探针，每条支持延伸探针主要包括５’端能与对应的目标基因ｍＲＮＡ结合的特异性序列Ｐ２、间隔臂序列、３’端能与对应的支持探针的特异性序列Ｐ１互补配对的Ｐ３序列，所述支持延伸探针的特异性序列Ｐ２包括有：针对ＴＯＰ２Ａ基因的选自ＳＥＱ．ＮＯ．５－ＳＥＱ．ＮＯ．１０中的２条或２条以上；针对Ｂ２Ｍ基因的选自ＳＥＱ．ＮＯ．１１－ＳＥＱ．ＮＯ．１５中的２条或２条以上，针对ＴＦＲＣ基因的选自ＳＥＱ．ＮＯ．１６－ＳＥＱ．ＮＯ．２０中的２条或２条以上，和针对ＴＢＰ基因的选自ＳＥＱ．ＮＯ．２１－ＳＥＱ．ＮＯ．２５中的２条或２条以上；所述支持延伸探针的Ｐ３序列选自：ＳＥＱ．ＮＯ．２６－ＳＥＱ．ＮＯ．２９；　　　　（３）扩增延伸探针，每条扩增延伸探针包括有５’端能与目标基因ｍＲＮＡ结合的特异性序列Ｐ４、间隔臂序列、３’端序列Ｐ５，３’端还修饰有生物素；所述扩增延伸探针的特异性序列Ｐ４包括有：针对ＴＯＰ２Ａ基因的选自ＳＥＱ．ＮＯ．３０－ＳＥＱ．ＮＯ．３９中的５条或５条以上；针对Ｂ２Ｍ基因的选自ＳＥＱ．ＮＯ．４０－ＳＥＱ．ＮＯ．４９中的５条或５条以上，针对ＴＦＲＣ基因的选自ＳＥＱ．ＮＯ．５０－ＳＥＱ．ＮＯ．５９中的５条或５条以上，和针对ＴＢＰ基因的选自ＳＥＱ．ＮＯ．６０－ＳＥＱ．ＮＯ．６９中的５条或５条以上；所述Ｐ５为不存在发夹结构、探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４和总ｍＲＮＡ之间均不存在非特异性结合的序列。...

【技术特征摘要】
1.一种TOP2A mRNA表达水平检测液相芯片，其特征是，主要包括有(1)与胺基修饰的支持探针偶联的微球，每条支持探针主要包括5’端的间隔臂序列和3’端的与支持延伸探针互补配对的特异性序列P1，所述支持探针选自SEQ.NO.1-SEQ.NO.4，每个目标基因选用一种微球，每种微球具有不同的荧光编码；(2)连接支持探针与目标基因mRNA的支持延伸探针，每条支持延伸探针主要包括5’端能与对应的目标基因mRNA结合的特异性序列P2、间隔臂序列、3’端能与对应的支持探针的特异性序列P1互补配对的P3序列，所述支持延伸探针的特异性序列P2包括有针对TOP2A基因的选自SEQ.NO.5-SEQ.NO.10中的2条或2条以上；针对B2M基因的选自SEQ.NO.11-SEQ.NO.15中的2条或2条以上，针对TFRC基因的选自SEQ.NO.16-SEQ.NO.20中的2条或2条以上，和针对TBP基因的选自SEQ.NO.21-SEQ.NO.25中的2条或2条以上；所述支持延伸探针的P3序列选自SEQ.NO.26-SEQ.NO.29；(3)扩增延伸探针，每条扩增延伸探针包括有5’端能与目标基因mRNA结合的特异性序列P4、间隔臂序列、3’端序列P5，3’端还修饰有生物素；所述扩增延伸探针的特异性序列P4包括有针对TOP2A基因的选自SEQ.NO.30-SEQ.NO.39中的5条或5条以上；针对B2M基因的选自SEQ.NO.40-SEQ.NO.49中的5条或5条以上，针对TFRC基因的选自SEQ.NO.50-SEQ.NO.59中的5条或5条以上，和针对TBP基因的选自SEQ.NO.60-SEQ.NO.69中的5条或5条以上；所述P5为不存在发夹结构、探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3、P4和总mRNA之间均不存在非特异性结合的序列。2.根据权利要求1所述的TOP2A mRNA表达水平检测液相芯片，其特征是，还包括有填充序列，针对TOP2A基因的选自SEQ.NO.70-SEQ.NO.71中的一条或多条；针对B2M基因的选自SEQ.NO.72-SEQ.NO.79中的一条或多条；和/或针对TFRC基因的选自SEQ.NO.80-SEQ.NO.83中的一条或多条。3.根据权利要求1或2所述的TOP2A mRNA表达水平检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂序列为5-10个T。4.根据权利要求1所述的TOP2A mRNA表达水平检测液相芯片，其特征是，所述P5的组成为CCTATTGCCTCCCCGTTGTCTA。5.一种TOP2A mRNA表达水平检测液相芯片，其特征是，主要包括有(1)与胺基修饰的支持探针偶联的微球，每条支持探针主要包括5’端的间隔臂序列和3’端的与支持延伸探针互补配对的特异性序列P1，所述支持探针选自SEQ.NO.1-SEQ.NO.4，每个目标基因选用一种微球，每种微球具有不同的荧光编码；(2)连接支持探针与目标基因mRNA的支持延伸探针，每条支持延伸探针主要包括5’端能与对应的目标基因mRNA结合的特异性序列P2、间隔臂序列、3’端能与对应的支持探针的特异性序列P1互补配对的P3序列，所述支持延伸探针的特异性序列P2包括有针对TOP2A基因的选自SEQ.NO.5-SEQ.NO.10中的2条或2条以上；针对B2M基因的选自SEQ.NO.11-SEQ.NO.15中的2条或...

【专利技术属性】
技术研发人员：许嘉森，郭元杰，罗彩英，吴诗扬，杨惠夷，
申请(专利权)人：广州益善生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]