一种用AFLP指纹技术鉴定青菜品种的方法技术

本发明专利技术公开了一种用ＡＦＬＰ指纹技术鉴定青菜品种的方法。在ＡＦＬＰ指纹技术的基础上，以特定不同青菜品种的基因池为模版，以限制性内切酶ＥｃｏＲ　Ｉ和Ｍｓｅ　Ｉ酶解，然后酶切片段跟含有与其共同粘性末端的人工接头连接，连接后的粘性末端顺序和接头顺序就作为以后ＰＣＲ反应的引物结合位点来设计引物，并以特定引物对青菜不同品种的预扩增、选择性扩增共两次扩增为依据，构建青菜品种的标准ＤＮＡ指纹图谱，将待定的青菜品种样本与标准图谱相比较，以鉴定待测样品的品种真实性。本发明专利技术为保护青菜育种产权、新品种登录、鉴定品种的真实性和纯度提供技术保障。

A method for identification of green vegetable varieties by AFLP fingerprinting

The invention discloses a method for identifying varieties of green vegetables by using AFLP fingerprint technology. Based on AFLP fingerprint technology, in particular the gene pool of different varieties of Brassica chinensis as the template, with restriction endonuclease EcoR I and Mse I enzyme, and then digested with fragments containing artificial joint together with sticky ends connected, after connecting the sticky end sequence and joint order as after the primer PCR binding reaction site to design primers and specific primers of vegetables in different varieties of pre amplification and selective amplification two times according to the standard fingerprint of DNA amplification, construction of varieties of vegetables, cabbage varieties and standard sample of undetermined compared to identify the authenticity of the sample to be varieties. The invention provides technical guarantee for protecting the vegetable breeding property rights, the registration of new varieties and the authenticity and purity identification of varieties.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及AFLP指纹技术鉴定青菜品种的方法。
技术介绍
传统的青菜品种鉴定方法主要是对植株形态进行观察，但由于大部分青菜品种苗期相似, 要到成株才开始表现品种的特性，所以从植株形态对青菜品种进行鉴定往往需要几个月的时 间。AFLP技术是一项分子标记技术，是基于PCR技术扩增基因组DNA限制性片段，基因组DNA先用限制性内切酶切割，然后将双链接头连接到DNA片段的末端，接头序列和相邻的 限制性位点序列，作为引物结合位点。它结合了RFLP和PCR技术特点，具有RFLP技术的 可靠性和PCR技术的高效性。由于AFLP扩增可使某一品种出现特定的DNA谱带，而在另 一品种中可能无此谱带产生，因此，这种通过引物诱导及DNA扩增后得到的DNA多态性可 做为一种分子标记。AFLP可在一次单个反应中检测到大量的片段，它是一种新的而且有很 大功能的DNA指纹技术。近年来，随着该技术的逐渐成熟，在品种鉴定及辅助育种上得到 了具体的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用AFLP指纹技术鉴定青菜品种的方法。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是 (1)基因池DNA的来源从不同青菜品种的叶片提取DNA，混合成品种的基因池。提取及纯化方法采用CTAB 法，其过程为取0.1g青菜叶片，液氮下研磨成粉末；加入750^x1 CTAB提取液后转入 1.5ml离心管中；然后65C水浴30min，其间震荡混匀；分别用等体积的Tris-饱和酚、氯 仿、异戊醇混合溶液和等体积的氯仿、异戊醇混合溶液各提取一次，于常温下在12000r/min 条件下离心2次，每次10min;取上清夜加入2倍的预冷的无水乙醇沉淀DNA，于4°C 条件下离心15min;离心转速为12000r/min，离心后用70%乙醇清洗沉淀2 3次；加入 双蒸水溶解DNA，经DNA纯度检测证实纯化度，存于一2(TC冰箱中备用。(2) AFLP接头和预扩增、选扩增引物序列设计接头的碱基序列 EcoR I接头 5'〉CTCGTAGACTGCGTACCCTGACGCATGGTTAA〈5'Mse I接头 5'>GACGATGAGTCCTGAGTACTCAGGACTCAT〈5'预扩增引物EcoR I预扩引物序列5'> GAC TGC GTA CCAATT CA< 3， Mse I 预扩引物序列5'> GAT GAG TCC TGA GTA AC<3'选扩增引物Mse I扩增引物用FAM标记 Pri證E GAC TGC GTA CCAATT CAA C/ Msel-3: GAT GAG TCC TGA GTAACA GPrimer E GAC TGC GTA CCA ATT CAA G/ Msel-2: GAT GAG TCC TGA GTA ACA CPrimer E GAC TGC GTA CCAATT CAA G / MseI-6: GAT GAG TCC TGA GTA ACT CPrimer E GAC TGC GTA CCA ATT CAA G/ Msel-8: GAT GAG TCC TGA GTA ACT TP匿r E GAC TGC GTA CCAATT CAC A/ Msel曙5 GAT GAG TCC TGA GTA ACT A(3) AFLP反应条件A、酶切和连接限制性酶切及连接(20ul反应体系)，在0.5ml离心管中加入对照模板DNA 4|J (50ngVl)， Adapter(il (Mse I接头50 pmoles/fiL, EcoR I接头5 pmoes/|JL)， EcoRI /Mse I 2^1 (4u/pl每种)，10xReaction buffer 2.5pl, 10mM ATP 2.5^1， T4 Ligase lpl Gu/^il), AFLP-Water 7pl ，混匀离心数秒，37。C保温5h ，8。C保温4h， 4°C 10h;B、 预扩增在0.2ml离心管中按下列方式加入(25ul反应体系)模板DNA2pl，预扩引物 1(il(50ng/)xl每种)，dNTPs lpl(幽M)， 10xPCR buffer 2.5nl， Taq DNA polymease 0.5^1 (2u/pl)， 水18^1,离心数秒，按下列参数进行PCR扩增循环30轮变性94'C2mm，(变性94°C 30s, 复性56°C 30s，延伸72°C 80s.)延伸72°C 5min;C、 选择性扩增将预扩产物l: 20稀释,作为选扩模板。选择性扩增休系在0.2ml离心管中，按下列方式加入体积(25pl体系)预扩增稀释样品2^1， 10xPCR buffer 2.5^1， dNTPS 0.5nl(10mM)， EcoRI引物(5ng/|il)， Mse I引物1^1 (30—1)， Taq酶0.5^1 (2u/pl)， H20 17.5^il，以上混匀，离心数秒，按下列参数PCR循环1轮扩增参数94°C 30s， 65。C 30s， 72'C80s，以后每轮循环温度递减0.7C，扩增12轮，接着按下列参数扩增23轮94°C 30s， 55。C 30s， 72°C 80s;D、 扩增产物的聚丙烯酰胺电泳预电泳20-30min，点样，电泳2.5h(电压1200V),电泳大 约1小时，小片段会先跑到胶的底部,测序仪激光管开始收集条带，胶图由测序仪软件自动生成。(4) AFLP图谱分析及标准的DNA指纹图谱的构建A、 GENESCAN软件分析用GENESCAN3.1软件打开胶图，对胶图进行数据提取，安 装胶图的MATRIX,选择合适的内标即SIZE STANDARD,分析得到结果；B、 通过Binthere软件提取样品的各片段大小的结果，打开Binthere软件，导入数据，选 择相应的荧光标记的颜色并选择合适的内标即SIZI STANDARD,点击分析，导出结果并将 结果保存为XLS格式；C、 EXCEL转换将表内的数值不为O转换为1，数值为0的不转换，从而生成由O和l组成的原始矩阵；D、 EXCEL转换生成的0， l矩阵图，构建标准的青菜DNA指纹图谱； (5)青菜品种的鉴定将待测青菜样本的指纹图谱与标准图谱相比较，以鉴定待测样本的品种真实性。 以上述AFLP扩增的结果为依据，构建青菜不同品种的标准DNA指纹图谱。 本专利技术与
技术介绍
相比，构建了一个客观、科学、准确的青菜品种鉴定技术体系，特别 是以标准样品的0， 1矩阵图构建标准的青菜DNA指纹图谱，克服以往用电泳图直接比较可 能产生的误差。该专利技术为保护青菜育种产权、新品种登录、鉴定品种的真实性和纯度提供技 术保障。 附图说明图1是引物Primer E GAC TGC GTA CCA ATT CAA C/ Msel-3: GAT GAG TCC TGA GTA ACAG扩增的10个青菜品种AFLP电泳图谱图2是引物Primer E GAC TGC GTA CCA ATT CAA C/ Msel-3: GAT GAG TCC TGA GTAACAG扩增的10个青菜品种AFLP的0， 1矩阵指纹图谱具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术作进一歩说明 实施例1(1本文档来自技高网...

【技术保护点】
１、用ＡＦＬＰ指纹技术鉴定青菜品种的方法，其特征在于其步骤如下：　（１）基因池ＤＮＡ的来源　从不同青菜品种的叶片提取ＤＮＡ，混合成品种的基因池。　（２）ＡＦＬＰ接头和预扩增、选扩增引物序列　接头的碱基序列：　Ｅｃｏ Ｒ　Ｉ接头　５′＞ＣＴＣＧＴＡＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣ　ＣＴＧＡＣＧＣＡＴＧＧＴＴＡＡ＜５′　Ｍｓｅ　Ｉ接头　５′＞ＧＡＣＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧ　ＴＡＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＡＴ＜５′　预扩增引物　ＥｃｏＲ　Ｉ预扩引物序列：５’ ＞ＧＡＣ　ＴＧＣ　ＧＴＡ　ＣＣＡ　ＡＴＴ　ＣＡ＜３’　Ｍｓｅ　Ｉ　预扩引物序列：５’＞ＧＡＴ　ＧＡＧ　ＴＣＣ　ＴＧＡ　ＧＴＡ　ＡＣ＜３’　选扩增引物　Ｍｓｅ　Ｉ扩增引物用ＦＡＭ标记　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｅ　ＧＡＣ　ＴＧＣ　ＧＴＡ　ＣＣ Ａ　ＡＴＴ　ＣＡＡ　Ｃ／ＭｓｅＩ－３：ＧＡＴ　ＧＡＧ　ＴＣＣ　ＴＧＡ　ＧＴＡ　ＡＣＡ　Ｇ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｅ　ＧＡＣ　ＴＧＣ　ＧＴＡ　ＣＣＡ　ＡＴＴ　ＣＡＡ　Ｇ／ＭｓｅＩ－２：ＧＡＴ　ＧＡＧ　ＴＣＣ　ＴＧＡ　ＧＴＡ　ＡＣＡ　Ｃ　Ｐｒｉｍｅ ｒ　Ｅ　ＧＡＣ　ＴＧＣ　ＧＴＡ　ＣＣＡ　ＡＴＴ　ＣＡＡ　Ｇ／ＭｓｅＩ－６：ＧＡＴ　ＧＡＧ　ＴＣＣ　ＴＧＡ　ＧＴＡ　ＡＣＴ　Ｃ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｅ　ＧＡＣ　ＴＧＣ　ＧＴＡ　ＣＣＡ　ＡＴＴ　ＣＡＡ　Ｇ／ＭｓｅＩ－８：ＧＡＴ　ＧＡＧ　ＴＣＣ　ＴＧ Ａ　ＧＴＡ　ＡＣＴ　Ｔ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｅ　ＧＡＣ　ＴＧＣ　ＧＴＡ　ＣＣＡ　ＡＴＴ　ＣＡＣ　Ａ／ＭｓｅＩ－５：ＧＡＴ　ＧＡＧ　ＴＣＣ　ＴＧＡ　ＧＴＡ　ＡＣＴ　Ａ　（３）ＡＦＬＰ反应条件　Ａ、酶切和连接限制性酶切及连接（２０ｕｌ反应体 系），在０．５ｍｌ离心管中加入对照模板ＤＮＡ４μｌ（５０ｎｇ／μｌ），Ａｄａｐｔｅｒ　１μｌ（Ｍｓｅ　Ｉ接头５０ｐｍｏｌｅｓ／μＬ，ＥｃｏＲ　Ｉ接头５ｐｍｏｌｅｓ／μＬ），ＥｃｏＲＩ／ＭｓｅＩ　２μｌ（４ｕ／μｌ每种），１０×Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ　２．５μｌ，１０ｍＭ　ＡＴＰ　２．５μｌ，Ｔ４　Ｌｉｇａｓｅ　１μｌ（３ｕ／μｌ），ＡＦＬＰ－Ｗａｔｅｒ　７μｌ，混匀离心数秒，３７℃保温５ｈ，８℃保温４ｈ，４℃１０ｈ；　Ｂ、预扩增在０．２ｍｌ离心管中按下列方式加入（２ ５ｕｌ反应体系）：模板ＤＮＡ　２μｌ，预扩引物１μｌ（５０ｎｇ／μｌ每种），ｄＮＴＰｓ　１μｌ（１０ｍＭ），１０×ＰＣＲ　ｂｕ...

【技术特征摘要】
CN 2007-8-30 200720113854.61、用AFLP指纹技术鉴定青菜品种的方法，其特征在于其步骤如下(1)基因池DNA的来源从不同青菜品种的叶片提取DNA，混合成品种的基因池。(2)AFLP接头和预扩增、选扩增引物序列接头的碱基序列EcoR I接头5′＞CTCGTAGACTGCGTACC CTGACGCATGGTTAA＜5′Mse I接头 5′＞GACGATGAGTCCTGAG TACTCAGGACTCAT＜5′预扩增引物EcoR I预扩引物序列5’＞GAC TGC GTA CCA ATT CA＜3’Mse I 预扩引物序列5’＞GAT GAG TCC TGA GTA AC＜3’选扩增引物Mse I扩增引物用FAM标记Primer E GAC TGC GTA CCA ATT CAA C/MseI-3GAT GAG TCC TGA GTA ACA GPrimer E GAC TGC GTA CCA ATT CAA G/MseI-2GAT GAG TCC TGA GTA ACA CPrimer E GAC TGC GTA CCA ATT CAA G/MseI-6GAT GAG TCC TGA GTA ACT CPrimer E GAC TGC GTA CCA ATT CAA G/MseI-8GAT GAG TCC TGA GTA ACT TPrimer E GAC TGC GTA CCA ATT CAC A/MseI-5GAT GAG TCC TGA GTA ACT A(3)AFLP反应条件A、酶切和连接限制性酶切及连接(20ul反应体系)，在0.5ml离心管中加入对照模板DNA4μl(50ng/μl)，Adapter 1μl(Mse I接头50pmoles/μL，EcoR I接头5pmoles/μL)，EcoRI/MseI 2μl(4u/μl每种)，10×Reaction buffer 2.5μl，10mM ATP 2.5μl，T4 Ligase 1μl(3u/μl)，AFLP-Water 7μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：李红斌，王世恒，王宏，
申请(专利权)人：杭州市农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]