一种细胞因子的组合物及其用途制造技术

本发明专利技术涉及一种细胞因子的组合物。本发明专利技术还涉及该细胞因子组合物的医药用途。本发明专利技术提供的一种细胞因子的组合物是干细胞培养液。本发明专利技术的优点在于：与目前流行的各种重组细胞因子制剂相比，细胞因子种类更加丰富，细胞因子活性更加接近天然状态，是一种具有巨大开发潜力的生物制剂。

Cytokine composition and use thereof

The present invention relates to a composition of cytokines. The invention also relates to the medicinal use of the cytokine composition. The composition of a cytokine provided by the invention is a culture medium for stem cells. The invention has the advantages that: compared with the various recombinant cytokines preparation popular kinds of cytokines, cytokine activity is more abundant, closer to the natural state, is a biological agent has great potential.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种细胞因子的组合物。本专利技术还涉及该细胞因子组合物的医药用途。技术背景胚胎干细胞是一类具有自我更新和多向分化能力的细胞，主要来自囊胚期的内细胞 团。目前，已经建立了多株人类以及哺乳动物的胚胎干细胞系，并且公众可以获得这些 干细胞系，例如美国政府资助在威斯康辛大学建立了国家级的干细胞库，储存有NIH注 册的21株人胚胎干细胞，可以为科研工作者和非盈利性机构提供良好的人胚胎干细胞 系(http:〃www.wicell.org/index,php option-com oscommerce&Itemid-130) c 而胚月台干 细胞的常规培养也具有一套公知的操作流程，在许多知名的干细胞中心如威斯康辛干细 胞库的网站上都有相应的操作手册对外提供 (http:〃www.wicell.org/index.php option=com content&task=section&id=9&Itemid=200)。研究发现胚胎干细胞在生长过程中能产生许多丰富的细胞生长因子，包括血小板源 性生长因子(PDGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、碱性成纤 维细胞生长因子(bFGF)等，这些细胞因子参与了创伤愈合的过程。有关生长因子在创 伤修复过程中的模式有人提出几点设想[1]':①蛋白生长因子应该直接调节正常创伤修 复的许多关键步骤,包括炎性细胞趋向性迁移,成纤维细胞、角化细胞和血管内皮细胞的 分裂增殖,新生血管的形成，细胞间质成分的合成和降解。②创伤愈合的周围环境应该含 有蛋白生长因子，在释放全过程中含量应该变化,生长因子的作用受到抑制时,创伤修复 则遇到障碍。(D慢性创伤的周围环境含有较低的生长因子活性。④生长因子应该促进慢 性创伤的愈合。TOGF是在寻求血清中促细胞增值因子的过程中被发现的(Ross et al. ， 1974) [2]'， 包括PDGFA和PDGFB两种异构体，作用包括促增值，存活，迁移，细胞外基质的沉积， 组织重构。血管的发生靠内皮细胞的发芽、分支、削枝来实现的。收縮间充质细胞包绕 这些原始的血管。两种主要的血管外细胞是血管平滑肌细胞和血管外膜细胞。他们分泌 抑制因子抑制内皮细胞的过度增殖。在PDGFB/PDGFBR基因敲除的小鼠常在出生前死于 血管包被不全的出血。血管内皮细胞分泌PDGFB;血管平滑肌、血管外膜细胞表达PDGFBR，PDGFB诱导血管平滑肌、血管外膜细胞迁移到新生的血管外。从而促进血管的正常发育。 VEGF家族因子的显著特征是对于内皮细胞的专一性。VEGF不是一种蛋白，而是由 许多由不同长度和氨基酸种类的多肽构成的混合物。1983年被作为血管通透性因子而被 发现[3]。 VEGF被看为是一种血管发生的动态调节因子。Kirchner等w报道局部运用VEGF 能縮短糖尿病小鼠溃疡愈合的时间将近50X。Galeano等[5]也指出运用VEGF基因治疗对 与糖尿病引起的创伤愈合障碍是一种很有前途的方法。表皮生长因子(EGF)是Cohen在研究神经生长因子的过程中发现的，研究发现人 的EGF同小鼠EGF —样能促进各种组织来源的上皮细胞的增殖活性。表皮生长因子家族 主要包括下列成员EGF、 TGF-a、 HB-EGF、 a卿hiregulin双调蛋白，印iregulin, betacellulin, neuregulins、印igen，其主要与四种受体结合，EGFR/ErbBl, HER2/ErbB2， HER3/ErbB3，和HER4/ErbB4，所有的EGFR合成后都以膜锚定的方式固定在膜表面，在 蛋白酶的作用下酶解为活性方式[6]。有趣的是酶解后，跨膜结构域仍能刺激临近细胞的 生长，说明无论是跨膜结构域还是可溶性的形式在创伤愈合过程中都发挥着作用。FGF家族目前认为由22个成员构成]。FGF的特征在于其能与肝素以及肝素类结合， 增加其对热以及蛋白酶的稳定性，同时对于其发挥受体激活的活性也是必须的。FGF主 要作为多种细胞的有丝分裂原活性，同时也能调节某些细胞的迁移和分化，在某些极端 情况下还能支持细胞存活的活性，[9]。按等电点不同分为碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)和酸性成纤维细胞生长因子(aFGF) 。 bFGF的生物学活性远大于aFGF。 bFGF是 动物和人体组织中存在的一种微量蛋白，对多种中胚层和神经外胚层来源的细胞具有广泛生物学活性,是一种多功能细胞因子[1°] 。 bFGF可趋化血管内膜的各类细胞,并诱导这 些细胞表达组织重建所需的血浆酶原激活剂、胶原酶和蛋白水解酶等;这些酶类通过促 使血管基底膜降解和刺激内膜各类细胞增殖与迁移,诱导血管内皮细胞长入胶原基质中 形成管腔并促进神经元及新生血管共同生长[11]。方培耀等[12]研究发现,创面愈合延迟与生长因子及其受体低表达有一定的关系。 目前，大多数细胞因子的产品采用基因工程的方法制备[15]—[18]，因子成分种类单一。
技术实现思路
本专利技术提供的一种细胞因子的组合物是干细胞培养液。本专利技术人通过研究发现，干细胞在培养过程中，能分泌各种细胞因子，这些细胞因 子进入到培养液中。以往培养胚胎干细胞后的培养基被丢弃，本研究所创造性的对胚胎 干细胞在生长过程中释放的细胞因子加以利用，变废为宝，节约了资源，为细胞因子用于临床治疗提供了一种具有巨大开发潜能的药物。根据本专利技术的实施例，收集到干细胞培养液中细胞因子PDGF、 VEGF、 EGF、 bFGF平 均含量依次为207.4±88. 7pg/ml、 206. 2 ±9. 6 pg/ml、 245. 9±78. 4 pg/ml、 33. 6 ±5. 3 pg/ml。上述细胞因子组合物的制备方法是每24小时收集一次胚胎干细胞培养液，并观 察胚胎干细胞培养状态，收集6天。将每天收集的培养液混合即可。收集到的细胞因子 组合物最好于一8(TC下储存。本专利技术还提供了该细胞因子的组合物的医药用途，即用于制备促进创伤愈合的药物。根据本专利技术的实施例，上述获得的细胞因子组合物，可以用于制备促进创伤愈合的 药物。药物理想的剂型为喷雾剂。本专利技术的优点在于与目前流行的各种重组细胞因子制剂相比，细胞因子种类更加 丰富，细胞因子活性更加接近天然状态，是一种具有巨大开发潜力的生物制剂。具体实施方式 实施例1. Feeder细胞的准备 病原学检测合格的人成纤维细胞经过丝裂霉素C处理后以3X 107cm2密度接种6孔板，37°C、 5%0)2培养，24小时-72小时后用于接种ES细胞。培养液使用D/F-12培养 基。成纤维细胞株按通用的方法获得。2. ES细胞的培养病原学检测合格的ES细胞采用按文献19—21中公开的方法获得人胚胎干细胞株， 以40-60clone/孔的密度接种在Feeder上，37°C、 5%0)2培养，每7天传代一次，每隔 24小时换液一次，收集每天的培养液，储存于4'C，最后将收集的液体混合，储存于一 80°C。3. 培养液细胞因子含量的检测与储存将6天收集的液体混合，作为一个批号的产品，取混合液0.5ml，用ELISA试剂盒 检测生长因子的含量，其余收集的液体经过0.25um滤器过滤后分装，并储存于4'本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细胞因子的组合物是干细胞培养液，其中含有细胞因子ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ。

【技术特征摘要】
1、一种细胞因子的组合物是干细胞培养液，其中含有细胞因子PDGF、VEGF、EGF、bFGF。2、 根据权利要求1所述的细胞因子组合物，其特征在于干细胞培养液中细胞因子 PDGF、 VEGF、 EGF、 bFGF平均含量依次为207. 4±88. 7pg/ml、 20...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢光琇，林戈，王建，
申请(专利权)人：湖南惠霖生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：43[中国|湖南]