在细胞培养物中增强细胞因子产生的方法技术

本发明专利技术涉及在哺乳动物细胞培养物中，通过修饰细胞中的细胞因子调节因子的水平，从而导致细胞因子的产生水平被增强的方法。本发明专利技术进一步地涉及这样的细胞系，它们表现出增强的细胞因子调节因子表达和增强的细胞因子表达。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及在细胞培养物中，通过PKR的过表达，用于增强细胞因子产生的方法。已经表明，PKR通过其磷酸化蛋白质合成起始因子eIF2以及I-κB(NF-κB的抑制剂；Kumar A等人，1994)和其它底物的能力，在翻译、转录和信号转导途径的调节中，扮演着多种重要的角色。PKR的表征得最清楚的体内底物是真核生物起始因子2的α亚基(eIF-2α)，一旦它被磷酸化，它最终导致细胞和病毒性蛋白质合成的抑制(Hershey，1991)。已经证实当PKR被双链RNA激活时，它在体外磷酸化起始因子eIF-2(Chong等人，1992)。归属到PKR的活性，包括它在下面三过程中扮演的角色(1)介导IFN-α和IFN-β的抗病毒和抗增殖活性，(2)未感染细胞对生理应激反应的应答，和(3)细胞生长的调节(Clemens MJ和Elia A，1997；Zamanian-Daryoush M等人，1999)另已建议PKR可以作为肿瘤抑制剂和细胞凋亡诱导剂而发挥功能(见，例如，Clemens MJ和Bommer UA，1999；Yeung，Lau等人，1996；Koromilas等人，1992)，最近的结果表明活性形式PKR的表达，很可能是通过Fas受体的去调节，触发细胞凋亡(Donze O等人，1999)。已进一步地表明当用编码PKR的表达载体转染具有产生干扰素能力的细胞系时，PKR的过表达诱导出更多的干扰素产生(WO97/08324)。干扰素蛋白质家族是细胞因子的原型，而且已表明它们在免疫防御抵抗病原和癌性组织中扮演着关键角色。细胞因子是表现出一系列生物学活性的调节性分子，并作用于广泛的靶细胞(见，例如，Balkwill FR和Burke，1989；Wong G和Clark S，1988；Clark S和Kamen R，1987)。一般地，当前是通过在昆虫、细菌和哺乳动物宿主细胞中表达重组的蛋白质，生产细胞因子。通过从哺乳动物细胞系纯化天然的细胞因子或者在昆虫、微生物或哺乳动物细胞中重组生产细胞因子，而将细胞因子用于多种治疗性用途。优选天然的细胞因子，这是由于已知它们含有某一给定细胞因子之天然形式的全部组成部分并且具有恰当的结构，但是它们很昂贵而且生产起来很费时间。重组生产的细胞因子制造起来相对便宜，但是随来源的不同，可能含有外源抗原，从而使施用了它们的对象产生免疫反应，或者由于与天然形式有结构差异，例如糖基化型式不同，而可能具有较低的活性。因而，能够用于增强天然细胞因子产生的方法，从而使它们不再那么昂贵，将是有优越性的。目前的方法是采用在微生物系统中表达细胞因子，它们不能够将细胞因子蛋白质糖基化和天然折叠，或者在人细胞中表达细胞因子，一般地这些人细胞产生的重组细胞因子的水平非常低。本专利技术涉及惊人的发现，即通过操作某些基因的表达，使得在培养的哺乳动物细胞中细胞因子的产生得到增强。一方面，本专利技术提供了生产细胞因子的方法，即通过培养已以一种方式被修饰的哺乳动物细胞系，所采用的修饰方式能够导致细胞因子调节因子的过表达，并且对所说的哺乳动物细胞系进行了处理，从而有效地产生细胞因子，接着收集由培养的、经处理的细胞系产生的细胞因子。在一个优选的实施方案中，细胞因子调节因子是PKR。在一个方法中，用具有启动子片段的表达载体对哺乳动物细胞系进行转染，该启动子片段能够在宿主细胞中发挥功能并且与编码细胞因子调节因子的DNA片段可操作地连接，这样以来，在细胞系中细胞因子调节因子被过表达。通过引发(priming)和诱导，例如采用佛波酯诸如乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)引发和采用dsRNA诸如poly r(I)∶poly r(C)诱导可以对细胞系进行处理，从而有效地产生细胞因子。引发是一种众所周知的现象，因此采用细胞因子或者其它化合物对细胞进行预处理，会导致相同的和/或另外的细胞因子在随后的刺激之后产生得到增强。用本专利技术方法可以增加的细胞因子表达的实例包括但不限于白细胞介素(IL-1α、IL-1β、IL-1ra、IL-2、IL-4至8)，肿瘤坏死因子α和β(TNF-β)，集落刺激因子(粒细胞集落刺激因子，G-CSF；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，GM-CSF；以及IL-3)，血管生成因子(成纤维细胞生长因子，FGF；血管内皮细胞生长因子，VEGF；以及血小板衍生的生长因子1和2(PDGF-1和-2)和抗-血管生成因子(制管张素(angiostatin)和内皮抑素(endostatin))。可以在可诱导型启动子例如金属硫蛋白启动子或四环素(TRE)启动子，或者组成型启动子例如CMV启动子的控制之下，表达细胞因子。本专利技术进一步地提供了细胞系组合物，其特征在于细胞因子调节因子例如PKR的高于正常表达以及细胞因子例如白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)或者肿瘤坏死因子β(TNF-β)的高于正常表达。当阅读了下面的本专利技术详述并结合所附的附图和实施例后，本专利技术的这些和其它目的及特性将会变得更加充分明显。图2表示在未被转化的Namalwa以及过表达PKR的Namalwa细胞中，白细胞介素8(IL-8)的产生，除了对培养上清液采用ELISA，根据ELISA试剂盒供应商(R&D Systems)提供的方法，分析其中IL-8的产生外，完全按附图说明图1中所描述出的方法进行。图3表示在未被转化的Namalwa以及过表达PKR的Namalwa细胞中，肿瘤坏死因子β(TNF-β)的产生，除了对培养上清液采用ELISA，根据ELISA试剂盒供应商(R&D Systems)提供的方法，分析其中TNF-β的产生外，完全按图1中所描述出的方法进行。专利技术详述I.定义术语“载体”指能够同化新核酸并且在合适的宿主中能够繁殖那些新序列的核苷酸序列。载体包括但不限于重组的质粒和病毒。本专利技术的载体(例如质粒或重组的病毒)，可以是处于一种携带体中，例如，与蛋白质复合的质粒，与基于脂质的核酸转导系统复合的质粒，或者其它非病毒性携带体系统。表达载体可以包含另外一些元件，例如，表达载体可以具有两种复制系统，从而允许其能够在两种生物体中保持，例如在哺乳动物或昆虫细胞中保持存在以表达以及在原核宿主中保持存在以克隆和扩增。无论是表达载体还是克隆载体，它们均包含能够使载体在一种或多种被选择的宿主细胞中复制的核酸序列。对于多种细菌、酵母和病毒，这样的序列众所周知。而且，对于整合型表达载体，表达载体含有至少一个与宿主细胞基因组同源的序列，优选地含有两个位于表达构建体侧翼的同源序列。通过选择合适的同源序列并将其插入到载体中，就可以将整合型载体导向宿主细胞中的特定位点。整合型载体的构建体为本领域所公知。表达和克隆载体一般含有选择性的标记基因，它编码这样的蛋白质(a)赋予对抗生素或其它毒素，例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素，的抗性(b)互补营养缺陷型，或者(c)提供无法从复合培养基中获得的关键营养物质，例如，编码杆菌(Bacilli)D-丙氨酸消旋酶的基因。在载体中，必须将核酸编码序列“可操作地连接”，这可通过将其置于与另一核酸序列处于功能关系之中而实现。例如，如果编码前序列(presequence)或分泌性前导序列(leader)的DNA被表达本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在哺乳动物细胞培养物中产生细胞因子的方法，它包括：（ａ）培养具有产生细胞因子能力的哺乳动物细胞系；（ｂ）以在细胞系中有效地导致细胞因子调节因子过表达的方式，修饰所说的培养的哺乳动物细胞系，其中在所说的细胞系中获得了高于正常水平的具有调节细胞因子表达能力的因子；（ｂ）处理所说的培养的、过表达细胞因子调节因子的哺乳动物细胞系，从而使细胞因子有效地产生；和（ｃ）收集由培养的、经处理的细胞系产生的所说的细胞因子。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：AS劳，L布朗宁，
申请(专利权)人：基因特罗生物治疗公司，
类型：发明
国别省市：US[]