本发明专利技术涉及一种聚电解质复合组合物，包含聚合物、核酸分子、冻干保护剂和缓冲剂。聚电解质复合组合物保持聚电解质复合物在冷冻干燥和再水化之后的生物学活性。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】 相关申请的参考 本申请要求要求于2013年6月10日提交的美国临时专利申请号61/833,010的权益 和优先权，其内容W其全部内容通过引用结合于此。
本专利技术设及在溶液中具有提高稳定性并对长期存储中的物理或化学降解具有改 善的抗性的聚电解质复合组合物;用于获得运种聚电解质复合组合物的方法W及运些聚电 解质复合组合物用于递送核酸的用途。
技术介绍
近年来已经付诸了大量努力W开发用于递送治疗药物的纳米颗粒组合物，治疗药 物如但不限于蛋白质、肤、脱氧核糖核酸(DNA)、如质粒(pDNA)和寡脱氧核巧酸(0DN)、W及 核糖核酸如小干扰核糖核酸(SiRNA)和小发夹核糖核酸(ShRNA)。然而，显示运些胶态组合 物在溶液中具有有限的稳定性，并长期储存容易发生物理或化学降解。。运个过程由3个主要步骤组成:冷冻、初级干燥和二 级干燥。它提供了在减少的体积中使干燥的组合物再水化W增加活性剂的浓度并达到治疗 剂量的可能性。运在自组装聚阳离子和核酸(NA)之间的聚电解质复合组合物的情况下是特 别令人感兴趣的，上述自组装需要在稀释条件下制备W产生小而尺寸均匀的纳米颗粒。 -般需要向组合物中加入冻干保护剂W防止冻干时不可逆的聚结和溶液中纳米 颗粒的官能度的损失。冻融研究允许识别待用于给定的组合物的潜在的冻干保护剂 。二糖(如薦糖、海藻糖、乳糖等），寡糖/多糖(如纤维素、葡聚糖等），聚合物(如PEG、 PVP等)等已经用作冻干保护剂W稳定长期存储的组合物。海藻糖也将是一个极好的 纳米颗粒冻干保护剂。然而，据发现在高溫下储存时，冷冻干燥的无定形二糖会 比多糖更容易结晶，增加复合物聚结的风险，但是多糖却被发现由于其蓬松是低效率 的冻干保护剂。寡糖可能是优越的稳定剂，因为它们具有二糖和多糖对于复合物最 佳稳定都具有的有利性质。已证明低分子量葡聚糖在冻干和再水化时保留阳离子多聚 物(polyplex)物理化学性质和功能方面是有效的，同时在体内和体外研究中与薦糖相比保 持了更高的细胞活力[1引。 缓冲剂可W用于稳定抑和防止在通过冻干过程的冷冻阶段时发生的溶质的低溫 浓缩期间纳米颗粒酸解。必须谨慎选择冻干期间使用的缓冲剂，因为在冷冻期间某些会 结晶或沉淀(憐酸盐、班巧酸盐或酒石酸盐），引起pH值变化最高达4个单位 DTg'， 指的是最大低溫浓缩的溶液的玻璃化转变溫度，是选择用于冷冻干燥的赋形剂时要考虑的 重要参数;它是能够实施初级干燥而不会影响最终产品的最高溫度的良好估计。巧樣酸钢 是非结晶性缓冲剂，因为其在不同pH值的较高1旨'及其接近中性的口1(3(口1(33 = 6.4)，其适用于冻干的可注射组合物。心组氨酸也能够是适用的，因为它的S个地a值之一 为6.1，它在冷冻干燥时在pH 5.5至6.5下几乎不表现出结晶，并且它具有高的Tg'（-33°C) 。使用赋形剂，主要是冻干保护剂和一些缓冲剂，对于用聚(D，!^-乳酸-共-乙醇酸） (化GA) (U.S. 2011/262490) 、聚（1-赖氨酸）。化）、聚乳酸（PLA) (U.S. 2011/ 0275704) 、明胶、聚乙締亚胺(PEI) 形成的冷冻干燥的聚电解质 复合组合物的开发，已经被表征。 基于PEI的纳米颗粒系统在冷冻干燥中是最特征化的。已经证实几种二糖在冷冻 干燥期间对于冻干保护PEI/NA纳米颗粒是有效的。现有的冻干保护剂筛选研究表明，需要 相对高浓度的薦糖(对于包含50iig DNA/mL的组合物相当于37.5% (wt/v)) W在冻融时保持 70kDa(重均分子量(Mw))支化PEI/DNA的粒径，但是会尽管导致在C(zeta)电位和转染效率 方面的急剧下降。更近期的工作表明，可W在浓度低得多的薦糖、乳糖或海藻糖(对于 包含50yg DNA/mL的组合物相当于1.25%(巧1八））中冷冻干燥2540曰(1^支化阳1/0魁复合 物而无颗粒聚结或体外转染损失，可接受的C电位增加（10~20mV)，和用乳糖组合物的最高 体内转染效率。甘露醇，W及薦糖或海藻糖，也可W用于防止干燥时PEI/DNA复合物的 聚结和冷冻效率的损失，但对于PEI/0DN或核酶复合物不需待冷冻干燥保护剂。 先前的研究证实，需要高薦糖/DNA重量比W在冷冻干燥时稳定纳米颗粒，导致组 合物与用于典型的质粒DM剂量的皮下（SC)或肌内（IM)注射不相容的同渗重摩 (osmolality)。 研究了使用葡聚糖（多糖）作为二糖的替代物来稳定冻干的70kDa(Mw)支化PEI/ DNA复合物的可能性。葡聚糖3kDa在保持复合物完整性方面与薦糖一样有效，同时降低了重 构溶液的同渗重摩约40% 。葡聚糖3W)a的/薦糖组合物能够浓缩高达10倍再水化到近 同渗重摩时的浓度，提供更适合体内注射的剂量(例如，lmg/mL)，如通过测定时不存在浊度 的变化确定的，在浓缩时不会改变粒径。然而，为了达到十倍浓度之后的那个最终浓度，在 加入冻干保护剂之前，必须W20化g/mL的初始DNA浓度制备颗粒，提示在运些组合物中的颗粒尺 寸和多分散性可W-直较高。此外，使用葡聚糖的主要缺点是它们已知的与PEG的不相容性，其稳定效果随着脂 质复合物（Iipoplexes)的PEG化的程度增加而降低。葡聚糖化Da防止聚乙二醇化的 阳I/DNA复合物完全聚结，但是粒径仍会增加170%至240% 。菊粉，另一种寡糖，是用于 聚乙二醇化的脂质复合物或阳离子多聚物的有效的冻干保护剂。。据发现葡聚糖是用于运些复合物的一种很差的冻干保护剂，而薦糖，在至 少2000的冻干保护剂/DNA重量比（对于含50yg DNA/mL的组合物相当于10%(w/v))下，在冷 冻干燥时会对其产生稳定作用。含14 %的乳果糖（Iactosucrose)、10 %径丙基0环糊精/ 6.5%薦糖或10%聚维酬/6.3%薦糖的等渗组合物在40°C下储存6个周的时间是稳定的，其 中颗粒小于170nm。乳果糖或径丙基0环糊精/薦糖组合物的体外最有效的。另一种缓冲 剂，pH 7的S乙醇胺，据发现对于保持PEI -甘露二糖(PE Im) /pDNA复合物在冷冻干燥时与 50%甘油组合是有效的。冷冻干燥的组合物能够存储在-20°C或4°C下长达30天，并仍然保 持200nm的粒径(wo 2010/125544)。 使用PEI共价结合至聚乙二醇（PEG)和胆固醇（畑ol)，PEG-PEI-畑ol(0.554mg/ mL)/pDNA(0.15mg/mL)，在乳糖或薦糖（0.3、1.5或3%(巧八））中制备的脂质阳离子多聚物 (Iipopolyplexes)可W被冷冻干燥和再水化成5、1或0.5mg/mL的最终DNA浓度，而无需向组 合物中加入缓冲剂。在-20或-80°C ,60%畑存储冷冻干燥的样品2年后或在重构和在4°C下 存储样品长达3个月之后(WO 2009/021017)，粒径或生物学活性(体外、体内、癌症患者中） 在运些组合物之间几乎没有看到变化。事实上，先前已经报道，脂质阳离子多聚物在低 薦糖含量(对于包含50g DNA/血的组合物相当于0.0625%(w/v))下经过冻融之后便不太易 于降解，而无需对其物理化学性质修饰且对照物的转染效本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种聚电解质复合组合物，包含聚合物、核酸分子、冻干保护剂和缓冲剂，所述组合物保持所述聚电解质复合物在冷冻干燥和再水化之后的生物学活性。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：迈克尔·D·布施曼，马尔科·拉韦尔图，丹尼尔·韦耶，
申请(专利权)人：波利威乐赞助有限公司，
类型：发明
国别省市：加拿大;CA
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