改进的细胞因子设计制造技术

本发明专利技术涉及蛋白质尤其是细胞因子设计的新方法。这些方法可以稳定细胞因子，并修饰它们对各自受体的选择性／特异性。本发明专利技术还涉及已经由本发明专利技术方法设计的各种修饰蛋白质。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及蛋白质尤其是细胞因子设计的新方法。这些方法可以稳定细胞因子，并修饰它们对各自受体的选择性/特异性。本专利技术还涉及已经由本专利技术方法设计的各种修饰蛋白质。细胞因子是主要由白细胞分泌的生长因子的家族，并且是在亚—纳摩尔浓度作为能够影响细胞过程的有效调节因子的信使蛋白质。它们的大小允许细胞因子迅速运输到全身并在需要时降解。它们在调控广泛细胞功能、尤其是免疫应答和细胞生长中的作用已经在过去二十年经过大量研究而被揭示(Boppana，S.B(1996)Indian.J.Pediatr.63(4)447-52)。这些作用包括免疫应答调节(Nishihira，J.(1998)Int.J.Mol.Med.2(1)17-28)、炎症(Kim，P.K.et al(2000)Surg.Clin.North.Am.80(3)885-894)、伤口愈合(Clark，R.A.(1991)J.Cell Biochem.46(1)1-2)、胚胎发生和发育、以及凋亡(Flad，H.D.et al(1999)Pathobiology.67(5-6)291-293)。至今，细胞因子的临床应用集中在它们作为免疫系统调节因子的作用上(Rodriguez，F.H.et al(2000)Curr.Pharm.Des.6(6)665-680)，例如促进抗甲状腺癌的应答(Schmutzler，C.et al(2000)143(1)15-24)。它们对细胞生长和分化的调控也使细胞因子成为抗癌靶标(Lazar-Molnar，E.et al(2000)Cytokine.12(6)547-554；Gado，K.(2000)24(4)195-209)。已经显示细胞因子和细胞因子受体的新突变在有些情况下产生疾病抗性(van Deventer，S.J.et al(2000)Intensive Care Med.26(Suppl 1)S98S102)。为了调节活性和消除潜在的副作用而创建合成细胞因子(突变蛋白质)也已经是重要的研究策略(Shanafelt，A.B.et al(1998)95(16)9454-9458)。因此细胞因子分子已经显示在多种生理功能中起作用，其中许多在疾病过程中起作用。改变其活性是改变疾病表型的手段，同样，鉴定新细胞因子分子具有重大的科学意义。特别感兴趣的是属于肿瘤坏死因子配体(TNF)家族的配体，这些蛋白质参与从细胞增殖到凋亡的广泛生物活动。TNF配体家族的成员通过与它们相应受体相互作用诱发导致凋亡或程序性细胞死亡(PCD)的信号通路。结合配体的受体通过将它们的细胞质部分紧密靠近传递跨膜信号，这引起下游效应蛋白质的募集和活化。凋亡是多细胞生物正常发育和稳态的基本过程。然而，凋亡调节受损似乎与癌症和几种慢性疾病的发病机理有关，所述慢性疾病包括获得性免疫缺陷综合征(自身免疫疾病和AIDS)和神经退行性疾病(例如帕金森氏病)。常见实例是慢性移植障碍、类风湿性关节炎、慢性阻塞性肺病(COPD)和哮喘。介导信号转导失调逆转的分子可能是有效的疾病治疗剂。TNF配体家族的成员也是免疫功能和免疫耐受的主要执行者。这个家族内在免疫刺激和免疫调节功能之间存在复杂平衡，以确保适当的免疫应答。TNF配体受体家族中的遗传多态性可以导致免疫稳态的调节异常。这种异常可以引起疾病发生。TNF家族的配体与其相应受体相互作用以触发几个信号通路，除了对组织的保护和致病作用以外，它们在对免疫耐受的调节和有害作用中也起关键作用(Rieux-Laucat et al.，2003，Current Opinion in Immunology 15325；Mackay andAmbrose，2003，Cytokine and growth factor reviews，14311；Mackay and Kalled，2002，Current opinion in Immunology，14783-790)。这样的蛋白质包括配体的实例，例如RANKL、TRAIL和APRIL，似乎与例如以下疾病状况有关类风湿性关节炎、自身免疫性糖尿病、系统性红斑狼疮(SLE)、斯耶格伦综合征、实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)、炎性肠病(IBD)、自身免疫性淋巴增生综合征(ALPS)和多发性硬化症。TNF配体家族成员的所有单体亚基由反平行β片层组成，组织成果冻卷样拓扑结构中，这些亚基自我结合成钟形同源三聚体，配体的生物活性形式。负责三聚体形成的(芳香族)残基之间的序列同源性是最高的。三聚体结合对应受体的三个亚基，每个受体亚基在两个邻近单体亚基之间的沟处结合。配体是II型跨膜蛋白质，但是一些成员的胞外结构域可以从细胞表面经蛋白水解切割，由此得到配体的生物活性的可溶性形式。TNF配体家族的最近的综述容易获得(Locksley et al.，Cell 104，487-501(2001)；Bodmer et al.，Trends Biochem.Sci.27，19-26(2002))。TNF配体家族成员的知识也可以应用于其它信号通路，这些通路由相同或其它家族内的配体受体相互作用而触发。尽管天然存在的细胞因子对科学界有重大意义，许多这些分子的特性并不必然适合它们在临床背景下的应用。例如，细胞因子的稳定性在整个生产过程和对终产物的储藏期限是重要的，还影响所述蛋白质治疗剂的药物代谢动力学和药效动力学(Marshall et al.，Drug Discov.Today 8，212-221(2003))。当前有几种策略被用于增加蛋白质的热稳定性(Fersht，A.& Winter，G.Protein engineering.Trends Biochem.Sci.17，292-295(1992)；Van den Burg et al.，Curr.Opin.Biotechnol.13，333-337(2002))。理性(Pantoliano et al.，Biochemistry 26，2077-2082(1987)；Van den Burget al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 95，2056-2060(1998)；Villegas et al.，Fold.Des 1，29-34(1996))和定向进化方法(Giver et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 95，12809-12813(1998)；Jung et al.，J.Mol.Biol.294，163-180(1999))两者都已经成功地用于提高稳定性。理性方法的缺点是只能设计少数潜在提高的变体。相反地，定向进化方法允许产生和筛选大量变体。然而，需要合适的选择/筛选操作，这经常没有或者是非常劳动密集的。新近，已经使用计算重新设计算法来增强蛋白质稳定性，以及其它性质(DeGrado et al.，Annu.Rev.Biochem.68，779-819(1999))。这些方法结合计算机设计步骤和计算机(in silico)筛选，由此可以筛选比可能用高通量技术实验筛选多得多的序列空间。需要高效算法来搜索大序列空间，并且需要精确的评分函数以排序最佳设计(Dantas et al.，J.本文档来自技高网...

【技术保护点】
β片层多聚体细胞因子，其序列已经通过突变所述多聚体细胞因子蛋白质的单体组分中的残基而被改变，以便相对于野生型未突变单体成分来改善所述单体的或所述多聚体复合物的自由能，使得比野生型、未改变的细胞因子蛋白质更稳定，其中所述突变的残基在所述细胞因子家族的同源性成员之间是非保守的。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】GB 2003-12-5 0328261.31.β片层多聚体细胞因子，其序列已经通过突变所述多聚体细胞因子蛋白质的单体组分中的残基而被改变，以便相对于野生型未突变单体成分来改善所述单体的或所述多聚体复合物的自由能，使得比野生型、未改变的细胞因子蛋白质更稳定，其中所述突变的残基在所述细胞因子家族的同源性成员之间是非保守的。2.根据权利要求1的细胞因子，其是TNF配体家族的成员。3.根据权利要求2的细胞因子，其是TRAIL。4.根据权利要求3的细胞因子，其在分子的可溶性C-端部分被突变。5.根据前面任一项权利要求的细胞因子，其在一个或多个以下位置被突变a)所述多聚体细胞因子的单体组分表面的非保守残基；b)接近于所述多聚体细胞因子的两个单体组分之间界面的非保守残基；c)对于三聚体细胞因子，沿着中心三聚体轴的非保守残基；d)混杂的残基，其突变是在能量方面有利的。6.根据权利要求5的细胞因子，其在连接C和D反平行β链的外部环(CD环)内被突变，符号根据Eck命名(Eck et al.，J.Biol.Chem.267，2119-2122(1992)。7.根据权利要求5a)部分的细胞因子，其在第194位和第196位的一个或两个位置被突变。8.根据权利要求7的细胞因子，其是包含突变E194I和/或I196S的TRAIL突变体。9.根据权利要求5b)部分的细胞因子，其在以下一个或多个位置突变125、163、185、187、232、234、237、203、205、239、241、271、274。10.根据权利要求9的细胞因子，其是包含突变D203I、Q205M和Y237F中一个或多个的TRAIL突变体。11.根据权利要求5c)部分的细胞因子，其在第227、230和240位的一个或多个位置被突变。12.根据权利要求11的细胞因子，其是包含突变R227M的TRAIL突变体。13.根据权利要求11的细胞因子，其是包含突变C230S和Y240F的TRAIL突变体。14.根据权利要求5d)部分的细胞因子，其在第123、272、225、280、163、123和208位的一个或多个位置被突变。15.根据权利要求14的细胞因子，其是包含突变S225A的TRAIL突变体。16.在权利要求5的a)至d)部分列出的超过一个位置被突变的细胞因子。17.根据权利要求16的细胞因子，其是包含突变E194I、I196S和S225A的TRAIL突变体。18.根据权利要求1-17中任一项的细胞因子，其中所述突变被导入所述细胞因子的可溶性形式。19.根据权利要求18的细胞因子，其是包含残基114-281的TRAIL突变体。20.对目标受体具有选择性的β片层多聚体细胞因子，其中所述细胞因子中位于受体结合界面的一个或多个氨基酸被替换为置换残基，所述置换残基包含预测与所述目标受体在结合界面配合的氨基酸侧链构象，以便提供所述细胞因子蛋白质增加对该目标受体的结合亲合性和选择性/特异性，前提是这些不是与所述细胞因子蛋白质结合的受体中保守氨基酸相互作用的残基。21.根据权利要求20的β片层多聚体细胞因子，其对特定目标受体具有改变的亲合性。22.对两个或多个目标受体具有选择性的β片层多聚体细胞因子，其中对第一个目标受体的选择性是通过将所述细胞因子中一个或多个氨基酸替换为置换残基而实现，以便降低对一个或多个不同目标受体的亲合性，前提是这些不是与所述细胞因子蛋白质结合的受体中保守氨基酸相互作用的残基。23.根据权利要求21或22的细胞因子，其在所述细胞因子中的第131、269、130、160、218、220、149、155、214、195、191和267位的一个或多个位置被突变。24.根据权利要求20-23中任一项的细胞因子，其是TNF配体家族的成员。25.根据权利要求24的细胞因子，其是TRAIL。26.根据权利要求25的细胞因子，其对DR5(TRAIL-R2)或DR4(TRAIL-R1)具有超过诱饵受体DcR1(TRAIL-R3)和DcR2(TRAIL-R4)的优异选择性。27.根据权利要求25的细胞因子，其对死亡受体5(TRAIL-R2)具有超过对死亡受体4(TRAIL-R1)选择性的优异选择性。28.根据权利要求27的细胞因子，其包含以下一个或多个突变G131R、D269H、D269K、D269R、R130E、G160K、D218R、G160M、I220M、I220H、R149D、R149H、E155M、T214R、E195R、R191E和D267R。29.根据权利要求27的细胞因子，其包含突变G160M或D269H。30.根据权利要求27的细胞因子，其包含突变D269H和T214R。31.根据权利要求27的细胞因子，其包含突变D269H和E195R。32.根据权利要求27的细胞因子，其包含突变R191E和D267R。33.根据权利要求25的细胞因子，其对死亡受体4(TRAIL-R1)具有超过对死亡受体5(TRAIL-R2)选择性的优异选择性。34.根据权利要求33的细胞因子，其包含突变D218Y、D218E、D218K、D218H和D218F中的一个或多个。35.对目标受体具有选择性的β片层多聚体细胞因子，其序列通过以下方式已经被改变a)突变所述多聚体细胞因子蛋白质的单体组分中的残基，以便相对于野生型未突变的单体组分改善所述单体或所述多聚体复合物的自由能，其中所述突变残基在该细胞因子家族的同源性成员之间是非保守的，以使比野生型、未改变的细胞因子蛋白质更稳定，和b)将所述细胞因子的位于受体结合界面的一个或多个氨基酸替换为置换残基，所述置换残基包含预测与所述目标受体在结合界面配合的氨基酸侧链构象，以便提供所述细胞因子蛋白质增加对该目标受体的结合亲合性和选择性/特异性，前提是这些不是与所述细胞因子蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：维森特R图尔，阿伯特马蒂纳斯万德斯洛特，玛格丽塔M马拉利，罗伯特H库尔，埃瓦E塞盖兹迪，阿夫申萨马利，格雷戈里奥费尔南德斯巴列斯特，路易斯塞拉诺，威廉默斯J夸克斯，
申请(专利权)人：格罗宁根大学，欧洲分子生物学实验室，爱尔兰国立大学，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]