人工纳米孔及其相关用途和方法技术

本发明专利技术涉及纳米孔及其在分析生物多聚体(包括多肽和多核苷酸)中的用途的领域。提供了包含亚基多聚组装体的人工纳米孔，每个亚基包含(i)β

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】人工纳米孔及其相关用途和方法
[0001]本专利技术总体上涉及纳米孔及其在分析生物多聚体和其他(生物)化合物中的用途的领域。具体地，它涉及人工纳米孔及其多蛋白组装体，以及它们在单分子分析(如单分子多肽测序)中的应用。
[0002]在细胞中，剪接和翻译后修饰在蛋白质群体中引起很大的异质性，而其不容易通过集成技术来解决。然而，今天不存在允许对单一蛋白质进行测序的技术。生物纳米孔正在成为强大的单分子工具。
[0003]通过在生物膜上形成纳米级孔的蛋白质的离子电流正在成为强大的单分子工具。与在固态膜上形成的纳米孔相比，生物纳米孔的优势在于它们以原子精度自组装，并且它们可以与天然的纳米机器进行交互，这些机器已经进化了数十亿年以处理生物分子。
[0004]最值得注意的是，由DNA加工酶辅助的纳米孔现在可被用于对DNA进行测序
1,2
。最近我们已经证明
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来自海葵Actinia fragacea的八聚体Fragaceatoxin C(FraC)纳米孔可被用于研究蛋白质和肽，并且在低pH值(即pH 3.8)下，从肽阻断物到FraC纳米孔的离子信号直接与肽的体积相关。另参见申请人名下的WO2018/012963。
[0005]蛋白质的鉴定和测序将需要设计和工程化能够控制多肽转运的新纳米孔。然而，由于蛋白质的折叠和组装不容易预测，因此使用多肽在纳米级的构建仍然极具挑战性。迄今为止，即使是在脂质双层中保持开口的蛋白质纳米孔的设计也尚未见报道，更不用说制备具有先进功能的纳米孔的制备。设计与完全由蛋白质制成的复杂分子机器连接的人工纳米孔的能力将扩大生物纳米孔在纳米技术中的使用，并将阐明有关膜蛋白结构的基本问题。复杂蛋白质结构的制造将解决纳米级组装中新出现的挑战。因此，构建强大的跨膜机器是纳米技术中的一个重要目标。
[0006]在单分子蛋白质测序的主流方法中，蛋白质在纳米孔中解折叠并逐步转移。在一项重要的概念验证工作(Nivala等人，Nat Biotechnol.2013Mar；31(3):47
–
250)中，由N
‑
末端多肽延长的蛋白质部分穿过α
‑
HL纳米孔，而在孔的另一侧以可溶性蛋白质的形式存在的ClpX解折叠酶通过将蛋白质相对于纳米孔的入口解折叠来有力地转移蛋白质。尽管可以鉴定蛋白质结构域，但由解折叠过程产生的复杂电流特征阻止了多肽序列的辨别。在另一种方法
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中，蛋白质可能在特定位点被切割，并且纳米孔电流被用于鉴定释放的肽。
[0007]因此，本专利技术的专利技术人旨在设计和工程化新的、基于蛋白质的纳米孔，其能够(作为多蛋白传感器复合物的一部分)解折叠蛋白质，控制它们通过纳米孔的进行性和单向运输，并通过离子电流辨别蛋白质。
[0008]令人惊讶的是，表明直接在纳米孔上方引入蛋白酶后，肽一被释放就被捕获和读取，从而提供了有利地用于对溶液中的蛋白质进行测序的人造纳米孔。更具体地，专利技术人设计并产生了稳定且低噪声的β
‑
桶状纳米孔，其与来自嗜酸热原体菌(Thermoplasma acidophilum)的20S蛋白酶体密封连接。后者是一种多亚基蛋白酶，可在各种条件下(包括高盐、高温和低pH值)降解多肽。令人惊讶的是，包含人工纳米孔的多蛋白组装体允许解折叠酶对接，其将选定的蛋白质线性化并送入蛋白酶体室中，而不影响纳米孔信号。在剪切和读取模式下，解折叠的多肽首先被蛋白酶体降解，然后被离子电流辨别。在线程和读取模式
下，解折叠酶将完整的底物穿过无活性的蛋白酶体并穿过纳米孔。然后通过纳米孔电流的特定调制鉴定线性化底物。这种集成的分子传感器有许多应用，例如在DNA或蛋白质测序和鉴定方面。
[0009]因此，本专利技术提供了包括蛋白质亚基的组装体的人工纳米孔，每个亚基包括：
[0010](i)β
‑
桶状或α
‑
螺旋成孔蛋白的跨膜(TM)氨基酸序列，其融合至(ii)控制多肽或多核苷酸跨所述组装体的TM区转运的成环蛋白的亚基的氨基酸序列。
[0011]此类纳米孔不同于根据WO2010/004265的酶孔构建体，后者公开了由与核酸处理酶共价连接的α
‑
溶血素构成的纳米孔。具体公开的核酸处理酶是核酸外切酶。然而，WO2010/004265描述了整个纳米孔与环状蛋白的融合，而不是根据本专利技术将跨膜区添加到环状蛋白中。
[0012]TM区
[0013]本文提供的人工纳米孔包含成孔蛋白的TM区。该TM区是在每个亚基中存在的多个TM序列组装后形成的，它们一起形成功能性人工纳米孔。通常，如在膜蛋白和成孔毒素中的天然跨膜区域中观察到的那样，TM序列反映了疏水性和亲水性以及甘氨酸残基的交替。成孔蛋白(PFP)通常由细菌产生，并且包括许多蛋白质外毒素(PFT，也被称为成孔毒素)，但也可能由其他生物体产生，如蚯蚓产生的胞溶素(lysenin)。它们通常具有细胞毒性(即它们会杀伤细胞)，因为它们会在靶细胞的膜中产生不受管制的孔。根据膜成分的二级结构，PFP可被分为使用两亲螺旋环构建孔的α
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PFP，或其中使用β
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桶状穿过膜的β
‑
PFP。
[0014]在一实施方案中，人工纳米孔包含α
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螺旋成孔蛋白的TM区。α
‑
成孔毒素在本领域中是众所周知的，并且包括大肠杆菌(E.coli)的溶血素E家族、海葵溶细胞素(actinoporins)、棒状杆菌孔蛋白B、细胞溶素A(ClyA)。优选地，使用FraC、ClyA、AhlB或Wza(大肠杆菌荚膜多糖的易位子)的TM区。
[0015]一方面，使用海葵溶细胞素或海葵溶细胞素样蛋白的TM序列。海葵溶细胞素(AP)是来自海葵的成孔毒素(参见Rojko等人，(BBA,第1858卷，第3期，2016，第446
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456页)的综述)。AP由β
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三明治组成，其两侧侧接有α
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螺旋。孔由α
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螺旋簇形成。AP在约40种不同的海葵物种中发现。迄今为止，表征最好的AP是来自海葵等指海葵(Actinia equine)的等指海葵毒素II(EqtII)、来自Stichodactyla helianthus的sticholysin I和II(StnI和StnII)以及来自Actinia fragacea的fragaceatoxin C(FraC)。一方面，使用了FraC的TM序列，其由序列SADVAGAVIDGAGLGFDVLKTVLEALGN组成。
[0016]在另一优选的实施方案中，使用了ClyA(细胞溶素A)蛋白家族的一个成员的α
‑
螺旋TM序列(PDB:2WCD(clya)和6GY6(XaxAB)。
[0017]例如，TM序列是QDLDEVDAGSMTEIVADKTVEV VKNAIETADGALDLYNKYLDQV(ClyA)、FTGAIGG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.包含亚基的多聚组装体的人工纳米孔，每个亚基包含：(i)β
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桶状或α
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螺旋成孔蛋白的跨膜(TM)序列，其融合至(ii)控制多肽或多核苷酸跨所述组装体的TM区转运的成环蛋白的亚基的氨基酸序列。2.如权利要求1所述的人工纳米孔，其包含α
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螺旋成孔蛋白的TM序列，优选地FraC、ClyA、AhlB或Wza(大肠杆菌(E.coli)荚膜多糖的易位子)的TM序列。3.如权利要求1所述的人工纳米孔，其包含β
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桶状成孔蛋白的TM序列，优选地α
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溶血素、气单胞菌溶素或炭疽保护性抗原(PA)的TM序列。4.如权利要求3所述的人工纳米孔，其中所述TM序列包括氨基酸序列VHGNAEVHASFFDIGGSVSAGF或由氨基酸序列VHGNAEVHASFFDIGGSVSAGF组成。5.如权利要求1
‑
4中任一项所述的人工纳米孔，其中所述TM序列在N
‑
末端或C
‑
末端与所述成环蛋白的亚基融合。6.如权利要求1
‑
4中任一项所述的人工纳米孔，其中所述TM序列被插入所述成环蛋白的亚基序列中。7.如权利要求1
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5中任一项所述的人工纳米孔，其中所述TM序列在N
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末端和/或C
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末端侧侧接有至少3个、优选地至少5个氨基酸的柔性连接子，更优选地，其中所述N
‑
末端连接子包括序列GSS或由序列GSS组成，和/或其中所述C
‑
末端连接子包括序列SSG或由序列SSG组成。8.如权利要求1
‑
7中任一项所述的人工纳米孔，其中所述成环蛋白是七聚体蛋白。9.如权利要求8所述的人工纳米孔，其中所述成环七聚体蛋白控制多核苷酸跨所述TM区的转运。10.如权利要求9所述的人工纳米孔，其中所述七聚体蛋白为ATP酶,优选地为风产液菌(A.aeolicus)ATP酶或其同源物或功能等效物。11.如权利要求8所述的人工纳米孔，其中所述成环七聚体蛋白控制多肽跨所述TM区的转运。12.如权利要求11所述的人工纳米孔，其中所述七聚体蛋白是蛋白酶体激活剂PA28、PA26或其同源物或功能等效物。13.如权利要求1
‑
12中任一项所述的人工纳米孔，其中所述包含所述TM序列的成环蛋白亚基的C
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末端与蛋白酶体α

【专利技术属性】
技术研发人员：乔瓦尼，
申请(专利权)人：格罗宁根大学，
类型：发明
国别省市：